發(fā)布時(shí)間：2017-06-12 01:02

  本文關(guān)鍵詞：突變敏感性分子開關(guān)篩查AAID熱點(diǎn)基因突變的條件優(yōu)化與應(yīng)用研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的:利用高保真聚合酶結(jié)合硫代磷酸化修飾的特異性檢測(cè)引物構(gòu)成的突變敏感性分子開關(guān),建立能夠準(zhǔn)確、快速識(shí)別mt DNA 12S r RNA基因A1555G、C1494T、961del T三個(gè)與AAID密切相關(guān)的熱點(diǎn)突變位點(diǎn)檢測(cè)平臺(tái)。通過該方法檢測(cè)mt DNA 12S r RNA基因A1555G、C1494T、961del T三個(gè)突變位點(diǎn)的有無,來指導(dǎo)Am An的合理用藥,預(yù)防AAID的發(fā)生。方法:以已構(gòu)建好的同時(shí)包含mt DNA 12S r RNA基因A1555G、C1494T、961del T三個(gè)位點(diǎn)的突變型質(zhì)粒和野生型質(zhì)粒為模板,利用高保真聚合酶結(jié)合硫代磷酸化修飾的特異性檢測(cè)引物構(gòu)成的突變敏感性分子開關(guān),對(duì)突變型質(zhì)粒模板和野生型質(zhì)粒模板分別進(jìn)行引物延伸反應(yīng),將其PCR產(chǎn)物通過凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行分析。通過調(diào)節(jié)PCR反應(yīng)過程中退火溫度、引物濃度、模板濃度等,優(yōu)化PCR反應(yīng)條件,然后在同一反應(yīng)體系中對(duì)包含mt DNA 12S r RNA基因A1555G、C1494T、961del T三位點(diǎn)突變型質(zhì)粒模板和野生型質(zhì)粒模板進(jìn)行PCR反應(yīng),并通過凝膠成像系統(tǒng)對(duì)其PCR產(chǎn)物進(jìn)行分析。采用優(yōu)化好的多重PCR反應(yīng)條件和反應(yīng)體系,確定所建立的檢測(cè)平臺(tái)的靈敏性。最后利用高保真酶介導(dǎo)突變敏感性分子開關(guān)對(duì)臨床志愿者的血液基因組DNA樣本進(jìn)行基因突變的篩查。結(jié)果:在一定的反應(yīng)體系和反應(yīng)條件下,突變檢測(cè)引物與野生模板不配對(duì),無PCR產(chǎn)物,而與突變模板相配對(duì),則有PCR產(chǎn)物。在優(yōu)化PCR反應(yīng)退火溫度的過程中,隨著退火溫度的升高,突變敏感性分子開關(guān)的特異性提高。在不同的反應(yīng)體系中,重組質(zhì)粒經(jīng)定量后,稀釋成108、107、106、105、104、103、102、101拷貝/μL濃度梯度作為模板,然后再以稀釋的質(zhì)粒分別作為模板,本課題所構(gòu)建的突變敏感性分子開關(guān)檢測(cè)平臺(tái)對(duì)于A1555G、C1494T的檢測(cè)靈敏度達(dá)到103拷貝,特異性達(dá)到106拷貝,961del T的檢測(cè)靈敏度達(dá)到102拷貝,特異性達(dá)到105拷貝,在同一反應(yīng)體系的多重引物延伸反應(yīng)中,對(duì)三位點(diǎn)突變進(jìn)行同時(shí)檢測(cè),突變重組質(zhì)粒經(jīng)定量后,稀釋成108、107、106、105、104、103、102、101拷貝/μL濃度梯度作為模板,本課題所構(gòu)建的突變敏感分子開關(guān)檢測(cè)平臺(tái)對(duì)于三位點(diǎn)同時(shí)檢測(cè)的靈敏度達(dá)到104拷貝。突變敏感性分子開關(guān)對(duì)50例臨床志愿者mt DNA 12S r RNA基因A1555G、C1494T、961del T突變的篩查均沒有發(fā)現(xiàn)A1555G、C1494T、961del T突變攜帶者。結(jié)論:利用突變敏感性分子開關(guān)技術(shù),建立了快速篩查AAID相關(guān)的三熱點(diǎn)突變的檢測(cè)平臺(tái),從而對(duì)氨基糖苷類抗生素的臨床用藥進(jìn)行指導(dǎo),預(yù)防AAID的發(fā)生。
【關(guān)鍵詞】：敏感性分子開關(guān) 氨基糖苷類抗生素性耳聾 線粒體DNA 高保真聚合酶
【學(xué)位授予單位】：南華大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R764.43
【目錄】：

• 摘要5-7
• Abstract7-11
• 第1章 緒論11-17
• 第2章 實(shí)驗(yàn)材料17-21
• 2.1 主要儀器17-18
• 2.2 主要試劑18-19
• 2.3 其他19-21
• 第3章 實(shí)驗(yàn)方法21-33
• 3.1 與生物信息學(xué)相關(guān)的網(wǎng)站及軟件21
• 3.2 主要溶液的配制21-22
• 3.3 檢測(cè)引物的設(shè)計(jì)22-23
• 3.4 體外制備含有熱點(diǎn)突變位點(diǎn)的野生型和突變型模板23-25
• 3.5 利用分子開關(guān)，在不同反應(yīng)體系中對(duì)mtDNA 12 SrRNA基因A1555G、C1494T和 961delT三個(gè)突變分別進(jìn)行檢測(cè)25-30
• 3.6 利用分子開關(guān)，在同一反應(yīng)體系中對(duì)mtDNA 12S rRNA基因A1555G、C1494T和 961delT三個(gè)突變同時(shí)進(jìn)行檢測(cè)30-31
• 3.7 利用分子開關(guān)，對(duì)50例志愿者的血液DNA樣本的檢測(cè)31-33
• 第4章 實(shí)驗(yàn)結(jié)果33-45
• 4.1 DNA的提取33-34
• 4.2 利用分子開關(guān)在不同反應(yīng)體系進(jìn)行檢測(cè)34-41
• 4.3 運(yùn)用分子開關(guān)技術(shù)，在同一反應(yīng)體系中對(duì)mtDNA 12S rRNA基因A1555G、C1494T和 961del T三個(gè)突變進(jìn)行檢測(cè)41-43
• 4.4 分子開關(guān)技術(shù)在臨床的應(yīng)用43-45
• 第5章 實(shí)驗(yàn)討論45-51
• 第6章 實(shí)驗(yàn)結(jié)論51-53
• 參考文獻(xiàn)53-57
• 綜述57-69
• 參考文獻(xiàn)65-69
• 碩士期間研究成果69-71
• 致謝71

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本文編號(hào)：442847