本文關鍵詞：酪氨酸促進人胚胎干細胞向視網(wǎng)膜色素上皮高效分化的研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的觀察酪氨酸(L-Tyrosine)對人胚胎干細胞(h ESCs)向視網(wǎng)膜色素上皮(RPE)細胞定向分化誘導效率的影響。方法1.人胚胎干細胞培養(yǎng)和人視網(wǎng)膜色素上皮細胞分離(1)人胚胎干細胞H1(h ESCs)在Matrigel包被的培養(yǎng)板上使用m Te SR培養(yǎng)基單層貼壁培養(yǎng)。觀察細胞形態(tài)。(2)酶消化法分離人視網(wǎng)膜色素上皮細胞,觀察細胞形態(tài),使用RP-PCR和Western blot檢測RPE標志。2.人胚胎干細胞向視網(wǎng)膜色素上皮細胞定向分化(1)誘導分化人胚胎干細胞H1(h ESC)分為對照組和實驗組,以m Te SR培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)。細胞克隆過度融合后對照組以撤除堿性成纖維細胞生長因子(b FGF)、含10%KSR的培養(yǎng)基誘導h ESCs自主分化。實驗組從誘導分化第14天開始在誘導體系中分別添加0.05 mmol/L、0.1 mmol/L、0.2 mmol/L、0.25 mmol/L和0.5 mmol/L酪氨酸,處理7天,探索最適酪氨酸誘導濃度;從誘導分化第0天、第7天、第14天、第21天和第28天開始在誘導體系中分別按篩選出的最適酪氨酸誘導濃度添加酪氨酸,處理7天,探索最適酪氨酸誘導時間點;使用酪氨酸最適誘導濃度在最適時間點開始誘導,處理7天。3.鑒定(1)體外功能鑒定分別檢測各組細胞誘導分化第35天、第49天,hRPE,hESCs和純化的h ESCs-RPE細胞MITF、RPE65、PAX6、CRALBP、RX、PEDF、ZO1、BF1、Tyrosinase、Wnt3a、Lef1、Tcf7、c-myc基因m RNA的相對表達;蛋白免疫印跡法檢測PAX6、MITF、RPE65、CRALBP和β-catenin蛋白的表達;流式細胞術檢測0.2 m M酪氨酸處理組和對照組PAX6、CRALBP、MITF、ZO1和RPE65陽性細胞比例;細胞免疫熒光檢測純化h ESCs-RPE PAX6、CRALBP、MITF、ZO1和RPE65蛋白表達水平。(2)h ESCs-RPE對急性視網(wǎng)膜變性大鼠視功能具有保護作用16只視網(wǎng)膜變性大鼠隨機分為對照組和治療組,單眼內路法視網(wǎng)膜下腔注射,對照組注射2ul 1倍磷酸鹽緩沖液,治療組注射2 ul純化的h ESCs-RPE(1x106個)。治療6周后行視網(wǎng)膜電圖(ERG)檢查,觀察暗適應3.0 a-b波振幅。結果1.誘導分化第22天,0.2 m M酪氨酸處理組開始出現(xiàn)肉眼可見的色素團塊,誘導分化第5周0.2 m M酪氨酸處理組色素團塊明顯多于對照組。色素化區(qū)域內可見多邊形蜂窩狀排列的單層細胞,胞質充滿色素顆粒,與人視網(wǎng)膜色素上皮細胞形態(tài)相近。2.RT-PCR結果顯示,經(jīng)單因素方差分析各濃度處理組在誘導分化第35天和第49天RPE特異性基因PAX6、CRALBP、MITF、RPE65、BF1、PEDF、RX、Tyrosinase和ZO1基因表達量均高于對照組(p=0.000),其中0.2 m M和0.5 m M處理組各基因第35天和49天表達量均明顯高于其他組(p=0.000);與對照組相比,各時間點使用0.2 m M L-Tyrosine對h ESCs-RPE誘導的RPE特異性基因PAX6、CRALBP、MITF、RPE65、BF1、PEDF、RX、Tyrosinase和ZO1的相對表達量差異均有統(tǒng)計學意義(P=0.000),其中d7、d21和d28加入0.2 m M L-Tyrosine處理組細胞MITF、RPE65、ZO1、Tyrosinase基因表達量明顯高于其他組(p=0.000)。酪氨酸處理組Wnt3a、Wnt2b、Wnt4、Wnt5a、Lef1、Myc、Tcf7 m RNA表達量高于對照組,差異有統(tǒng)計學意義(p=0.000)。Western blot檢測結果顯示,酪氨酸處理組MITF、RPE65、CRALBP、PAX6、β-catenin蛋白表達量高于對照組。ICC檢測結果顯示純化的h ESCs-RPE表達RPE標志蛋白RPE65、PAX6、CRALBP、ZO1和MITF。FCM檢測結果顯示,誘導分化第35天L-Tyrosine處理組MITF、PAX6和RPE65陽性比例分為25.97%±3.31%,82.18%±6.42%,13.82%±0.47%,對照組分別為9.53%±1.01%,31.72%±5.89%,6.13%±1.18%,差異顯著(t=4.755,p=0.009;t=5.794,p=0.029;t=6.067,p=0.004)。誘導分化第49天L-Tyrosine處理組MITF、CRALBP和RPE65陽性比例分為60.65%±1.71%,24.38%±2.21%,44.70%±2.10%,對照組分別為17.41%±1.29%,10.92%±1.53%,8.72%±0.73%,差異顯著(t=20.18,p=0.000;t=5.150,p=0.007;t=16.19,p=0.000)ERG檢查結果顯示,視網(wǎng)膜下腔注射h ESC-RPE 6周后視網(wǎng)膜變性大鼠暗適應0.01,3.0和30.0 a-b波幅較對照組顯著提高(P0.01)。結論酪氨酸顯著提高h ESCs向RPE定向誘導效率,對Wnt/β-catenin信號通路活性的影響為其可能的作用機制。h ESCs誘導來源的RPE細胞視網(wǎng)膜下移植能改善急性視網(wǎng)膜變性模型動物視功能。
【關鍵詞】：胚胎干細胞 分化 視網(wǎng)膜色素上皮 酪氨酸
【學位授予單位】：天津醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R774.1
【目錄】：

• 中文摘要4-7
• Abstract7-11
• 縮略語/符號說明11-12
• 前言12-15
• 研究現(xiàn)狀、成果12-13
• 研究目的、方法13-15
• 1.1 材料和儀器15-21
• 1.1.1 實驗所用細胞15
• 1.1.2 實驗所用動物15
• 1.1.3 實驗所用主要試劑15-17
• 1.1.4 實驗所用主要儀器和耗材17-18
• 1.1.5 實驗所用溶液及制方法18-21
• 1.2 實驗方法21-39
• 1.2.1 細胞培養(yǎng)21-27
• 1.2.1.1 人胚胎干細胞H1體外培養(yǎng)、傳代21-23
• 1.2.1.2 人胚胎干細胞 H1 向人視網(wǎng)膜色素上皮細胞定向誘導23-24
• 1.2.1.3 人胚胎干細胞源性視網(wǎng)膜色素上皮細胞的分離、純化培養(yǎng)、傳代和凍存24-26
• 1.2.1.4 人視網(wǎng)膜色素上皮細胞（h RPE）的分離、體外純化培養(yǎng)、傳代和凍存26-27
• 1.2.2 細胞總 RNA 提取及濃度測定27-28
• 1.2.3 RNA 逆轉錄合成單鏈cDNA28
• 1.2.4 實時熒光定量聚合酶鏈反應28-30
• 1.2.5 細胞蛋白提取及濃度測定30-32
• 1.2.6 免疫印跡試驗鑒定hESCs-RPE細胞32-33
• 1.2.7 細胞免疫熒光試驗鑒定hESCs-RPE細胞33-34
• 1.2.8 流式細胞術檢測 L-Tyrosine 處理組和對照組誘導效率34-36
• 1.2.9 碘酸鈉誘導急性視網(wǎng)膜變性大鼠模型36
• 1.2.10 純化的 h ESCs-RPE 移植對急性視網(wǎng)膜變性大鼠視功能保護作用36-37
• 1.2.11 L-Tyrosine 促進人胚胎干細胞向視網(wǎng)膜色素上皮細胞高效分化機制的初步研究37-39
• 1.3 結果39-62
• 1.3.1 人胚胎干細胞 H1 體外培養(yǎng)的形態(tài)學特征39
• 1.3.2 不同濃度 L-Tyrosine 對 h ESCs-RPE 誘導效率的影響39-43
• 1.3.3 不同時間點 L-Tyrosine 處理對 h ESCs-RPE 誘導效率的影響43-46
• 1.3.4 形態(tài)學觀察比較 L-Tyrosine 處理組與對照組誘導效率46-47
• 1.3.5 流式細胞學檢測比較 L-Tyrosine 處理組與對照組誘導效率47-51
• 1.3.6 人視網(wǎng)膜色素上皮細胞的體外培養(yǎng)和鑒定51
• 1.3.7 hESCs-RPE細胞純化和鑒定51-56
• 1.3.8 視網(wǎng)膜下腔移植 h ESCs-RPE 對急性視網(wǎng)膜色素變性大鼠模型視功能的保護作用56-57
• 1.3.9 L-Tyrosine 促進人胚胎干細胞向視網(wǎng)膜色素上皮細胞高效分化的可能的機制研究57-62
• 1.4 討論62-67
• 1.4.1 人胚胎干細胞向視網(wǎng)膜色素上皮細胞定向誘導62-63
• 1.4.2 RPE 細胞特異性標記63-64
• 1.4.3 hRPE獲取和鑒定64-65
• 1.4.4 L-Tyrosine 促進人胚胎干細胞向視網(wǎng)膜色素上皮定向高效分化65-66
• 1.4.5 hESCs-RPE體內功能初步鑒定66-67
• 結論67-68
• 參考文獻68-71
• 發(fā)表論文和參加科研情況說明71-72
• 綜述72-76
• 綜述參考文獻76-79
• 致謝79

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