本文關(guān)鍵詞：染料木素對(duì)喉癌Hep-2細(xì)胞系功能的影響，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的:喉癌(laryngeal carcinoma)是頭頸部常見(jiàn)的惡性腫瘤之一,在全球,喉癌占全身腫瘤的2.4%[1],其病理類(lèi)型主要為鱗狀細(xì)胞癌(laryngal squamous cell carcinoma,LSCC)。每年有超過(guò)15萬(wàn)的新發(fā)喉癌患者(Globocan 2012)。在中國(guó),以東北、華北和華東地區(qū)發(fā)病率最高[2]。喉癌的病因迄今尚不完全明了,可能與吸煙、酗酒、空氣污染、人類(lèi)乳頭瘤病毒感染等有關(guān)。目前,主要的治療手段為手術(shù)、放療、化療及生物治療等。雖然早期喉癌治療效果較好,但晚期喉癌療效和預(yù)后仍不盡人意,生存率低,并發(fā)癥多,嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量,因而尋求有效的新的診治指標(biāo)意義重大。隨著分子生物學(xué)及其技術(shù)的飛速發(fā)展,人們對(duì)喉癌發(fā)生、發(fā)展及其分子機(jī)制的研究更加深入。關(guān)于喉癌的發(fā)生發(fā)展的相關(guān)通路的研究也越來(lái)越受到重視。染料木素(染料木黃酮Genistein,Gen),又名4’,5’,7’-三羥基異黃酮,是在大豆異黃酮復(fù)合物中含量最高、營(yíng)養(yǎng)價(jià)值最高的一種。染料木素是具有抗癌癥作用的生物毒素單體。本課題組前期研究表明低濃度的染料木素能引起bcl-2基因m RNA相對(duì)表達(dá)量降低,當(dāng)濃度增加至24μg/ml時(shí),也可減少Survivin的表達(dá);染料木素還可誘導(dǎo)Hep-2細(xì)胞發(fā)生細(xì)胞周期阻滯,主要阻滯在G2期,隨藥物濃度升高,S期阻滯的比率也增高。近來(lái)研究發(fā)現(xiàn),染料木素能促進(jìn)多種腫瘤細(xì)胞的凋亡,抑制癌細(xì)胞增殖和侵襲的能力,并通過(guò)介導(dǎo)PI3K/AKT信號(hào)通路調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)[3]。血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體-3(vascular endothelial growth factor receptor-3,VEGFR-3)是受體酪氨酸激酶的一種,與VEGF-C及VEGF-D特異性結(jié)合后,可誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞增殖及遷移,調(diào)控血管及淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞的新生,對(duì)胚胎發(fā)育及腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移起著重要的調(diào)節(jié)作用[4]。VEGFR-3在大多數(shù)惡性腫瘤細(xì)胞中高表達(dá),最近的研究表明,抑制VEGFR-3的表達(dá)通過(guò)調(diào)節(jié)AKT[4]、ERK[5]等下游信號(hào)通路,可誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡、抑制腫瘤的增殖及侵襲能力。先前的研究證實(shí),染料木素對(duì)前列腺癌細(xì)胞[6]、乳腺癌細(xì)胞[7,8]、胃腺癌細(xì)胞[9]、人結(jié)腸癌細(xì)胞[10]及人肝癌細(xì)胞[11]等有明顯抑制作用,對(duì)喉癌細(xì)胞的作用卻鮮有報(bào)道,另外,此類(lèi)作用的相關(guān)機(jī)制也不清楚。因此,我們將研究染料木素對(duì)喉癌細(xì)胞功能的影響,探討染料木素對(duì)喉癌細(xì)胞的“抗腫瘤作用”的相關(guān)機(jī)制,分析染料木素對(duì)喉癌細(xì)胞中VEGFR-3/PI3K/Akt/GSK-3β通路的影響。為染料木素應(yīng)用于喉癌治療提供理論基礎(chǔ),為最終提高臨床喉癌的治療效果尋找新的途徑。方法:對(duì)照組:①Control組,用含10%胎牛血清RPMI 1640培養(yǎng)(后簡(jiǎn)稱(chēng)完全培養(yǎng)基)48小時(shí),24小時(shí)換一次液;實(shí)驗(yàn)組:②MAZ51組,MAZ51為VEGFR-3的特異性阻滯劑,完全培養(yǎng)基培養(yǎng)18小時(shí)后,換含5μmol/L MAZ51的完全培養(yǎng)基預(yù)干預(yù)細(xì)胞6小時(shí),更換為完全培養(yǎng)基培養(yǎng)24小時(shí);③LY294002組,LY294002為PI3K的特異性阻滯劑,完全培養(yǎng)基培養(yǎng)18小時(shí)后,換含25μmol/L LY294002的完全培養(yǎng)基預(yù)干預(yù)細(xì)胞6小時(shí),換為完全培養(yǎng)基培養(yǎng)24小時(shí);④Gen組,完全培養(yǎng)基培養(yǎng)24小時(shí)后,更換為含12μmol/L染料木素的完全培養(yǎng)基作用細(xì)胞24小時(shí);⑤MAZ51+Gen組,完全培養(yǎng)基培養(yǎng)18小時(shí)后,換為含5μmol/L MAZ51的完全培養(yǎng)基預(yù)干預(yù)細(xì)胞6小時(shí),更換為含12μmol/L染料木素的完全培養(yǎng)基作用細(xì)胞24小時(shí);⑥LY294002+Gen組,完全培養(yǎng)基培養(yǎng)18小時(shí)后,換為含25μmol/L LY294002的完全培養(yǎng)基預(yù)干預(yù)細(xì)胞6小時(shí),更換為含12μmol/L染料木素的完全培養(yǎng)基作用細(xì)胞24小時(shí)。1流式細(xì)胞術(shù)(flow cytometry,FCM)檢測(cè)Hep-2細(xì)胞系各組間細(xì)胞凋亡的情況;2 CCK-8法檢測(cè)不同濃度(0μmol/L,2.5μmol/L,5μmol/L,10μmol/L,20μmol/L,40μmol/L)染料木素對(duì)Hep-2細(xì)胞系增殖的影響;3 Transwell小室檢測(cè)Hep-2細(xì)胞系各組間細(xì)胞的遷移能力和侵襲能力;4反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)檢測(cè)不同濃度(0μmol/L,12μmol/L,24μmol/L)染料木素對(duì)VEGF家族各成員基因m RNA表達(dá)的影響;5實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(Real-Time PCR)檢測(cè)12μmol/L染料木素對(duì)Hep-2細(xì)胞系VEGFR-3和PI3K基因m RNA表達(dá)的影響;6 Western blot檢測(cè)各組間AKT、GSK-3β蛋白表達(dá)及其磷酸化水平的改變。結(jié)果:1單獨(dú)使用染料木素、MAZ51和LY294002均能誘導(dǎo)Hep-2細(xì)胞系凋亡,MAZ51和染料木素、LY294002和染料木素兩兩合用對(duì)Hep-2細(xì)胞系的凋亡誘導(dǎo)作用明顯增強(qiáng),與單獨(dú)使用染料木素組比較有差異,與單獨(dú)使用MAZ51或LY294002的組比較無(wú)明顯差異。而MAZ51是VEGFR-3的特異性阻滯劑,LY294002是PI3K的特異性阻滯劑。當(dāng)VEGFR-3或PI3K被特異性阻滯后,染料木素幾乎不起作用,可推導(dǎo)染料木素的促凋亡作用是通過(guò)VEGFR-3,PI3K發(fā)揮作用的;2染料木素可抑制Hep-2細(xì)胞系的增殖,且抑制作用呈劑量依賴(lài)性;3單獨(dú)使用染料木素、MAZ51和LY294002均能抑制Hep-2細(xì)胞的遷移能力和侵襲能力,MAZ51和染料木素、LY294002和染料木素兩兩聯(lián)合應(yīng)用對(duì)Hep-2細(xì)胞系的遷移和侵襲的抑制作用更強(qiáng),與單獨(dú)使用染料木素組比較有差異,與單獨(dú)使用MAZ51或LY294002的組比較無(wú)明顯差異。推導(dǎo)染料木素的促凋亡作用是通過(guò)VEGFR-3,PI3K發(fā)揮作用的;4 VEGFR-3在Hep-2細(xì)胞中表達(dá)恒定,且染料木素對(duì)VEGFR-3 m RNA的表達(dá)有抑制作用;5染料木素能抑制Hep-2細(xì)胞系的VEGFR-3和PI3K m RNA表達(dá),抑制率分別為32%和63%;6單獨(dú)使用染料木素、MAZ51和LY294002均能抑制Akt蘇氨酸位點(diǎn)及絲氨酸位點(diǎn)和GSK-3β絲氨酸位點(diǎn)磷酸化的激活,使p-Akt(Thr308),p-Akt(Ser473)和p-GSK-3β(Ser9)蛋白表達(dá)的減少,MAZ51和染料木素,LY294002和染料木素兩種藥物合用抑制率更高。結(jié)論:1染料木素能促進(jìn)Hep-2細(xì)胞的凋亡、抑制Hep-2細(xì)胞的增殖能力、遷移能力和侵襲能力。2染料木素能抑制VEGFR-3和PI3K的表達(dá)。3染料木素能抑制Akt和GSK-3β蛋白的磷酸化。4推導(dǎo)染料木素可作用于VEGFR-3/PI3K/Akt/GSK-3β信號(hào)通路發(fā)揮抗腫瘤作用的。
【關(guān)鍵詞】：染料木素 血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體3 MAZ51 LY294002 Akt GSK-3β 人鱗狀細(xì)胞喉癌
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類(lèi)號(hào)】：R739.65
【目錄】：

• 中文摘要4-7
• 英文摘要7-11
• 英文縮寫(xiě)11-12
• 前言12
• 材料與方法12-32
• 結(jié)果32-36
• 附圖36-45
• 附表45-46
• 討論46-48
• 結(jié)論48
• 參考文獻(xiàn)48-54
• 綜述 染料木素的抗腫瘤作用的研究進(jìn)展54-66
• 參考文獻(xiàn)60-66
• 致謝66-67
• 個(gè)人簡(jiǎn)歷67

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