研究目的:聽力障礙是目前影響人類健康最為多見的疾病之一。而巨細(xì)胞病毒是引發(fā)嬰幼兒先天性感染極為多見的病原體,同時(shí)也是導(dǎo)致人類非遺傳性耳聾的主要原因。近年來,迅猛發(fā)展的高通量測(cè)序技術(shù)以及生物信息技術(shù),使非編碼RNA的研究更為深入。有研究報(bào)道巨細(xì)胞病毒感染后會(huì)引起非編碼RNA表達(dá)變化,但缺少對(duì)巨細(xì)胞病毒感染致聾的過程中非編碼RNA差異表達(dá)的相關(guān)報(bào)道。本研究擬通過構(gòu)建的小鼠巨細(xì)胞病毒感染耳蝸感覺上皮細(xì)胞模型,用高通量檢測(cè)技術(shù)對(duì)其進(jìn)行全轉(zhuǎn)錄組測(cè)序,檢測(cè)巨細(xì)胞病毒感染72 h的耳蝸感覺上皮細(xì)胞中非編碼RNA的表達(dá)情況,利用生物信息學(xué)技術(shù)分析了各種非編碼RNA的基本特點(diǎn),篩選出差異表達(dá)的明顯的非編碼RNA并用qPCR方法進(jìn)行驗(yàn)證。此項(xiàng)研究將探究出與巨細(xì)胞病毒感染耳聾致病相關(guān)的差異表達(dá)的非編碼RNA,為從轉(zhuǎn)錄層面及非編碼RNA角度進(jìn)一步研究巨細(xì)胞病毒的致聾機(jī)制奠定了基礎(chǔ),并為后續(xù)進(jìn)一步研究提供新的方向。研究方法:1.小鼠耳蝸上皮細(xì)胞（MCEC）、小鼠胚胎成纖維細(xì)胞（Balb/3T3）的培養(yǎng)。2.小鼠巨細(xì)胞病毒毒株（Smith株）的制備和TCID50測(cè)定病毒滴度,繪制病毒在小鼠胚胎成纖維細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線... 

【文章來源】：中國醫(yī)科大學(xué)遼寧省

【文章頁數(shù)】：65 頁

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【部分圖文】：

1MCMV感染Balb/3T3不同時(shí)間點(diǎn)熒光顯微鏡觀察情況

中國醫(yī)科大學(xué)碩士學(xué)位論文19圖3.1.2MCMV一步生長(zhǎng)曲線3.2MCMV感染與未感染72h小鼠耳蝸上皮細(xì)胞模型MCMVSmith株帶有綠色熒光標(biāo)簽，可在熒光顯微鏡下觀察其在細(xì)胞中的感染情況。MCMV感染MCEC72h時(shí)，處于病毒增長(zhǎng)的指數(shù)期，此時(shí)細(xì)胞內(nèi)病毒復(fù)制活躍，細(xì)胞感染率較高。abc圖3.1MCMV感染與未感染72h小鼠耳蝸上皮細(xì)胞顯微鏡下圖a為實(shí)驗(yàn)組MCMV感染小鼠耳蝸上皮細(xì)胞72h熒光顯微鏡下觀察結(jié)果，b為MCMV感染小鼠耳蝸上皮細(xì)胞72h光學(xué)相差顯微鏡下觀察結(jié)果：可見受感染的細(xì)胞邊緣清晰可見，細(xì)胞變大，聚集，脫落、融合形成包涵體，甚至損傷、死亡等細(xì)胞病變效應(yīng)(CPE)，c為對(duì)照組未感染的小鼠耳蝸上皮細(xì)胞72h光學(xué)相差顯微鏡下觀察結(jié)果：細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好，未出現(xiàn)細(xì)胞病變效應(yīng)。3.3測(cè)序樣品質(zhì)檢結(jié)果及預(yù)處理結(jié)果提取MCMV感染72h和未感染72h的小鼠耳蝸感覺上皮細(xì)胞的總RNA，設(shè)

中國醫(yī)科大學(xué)碩士學(xué)位論文20置三組生物學(xué)重復(fù)，共六個(gè)樣本進(jìn)行定量及質(zhì)檢。RNA樣品建庫質(zhì)量要求如下：表3.3.1RNA樣品建庫質(zhì)量要求所有RNA樣品符合RNA-Seq樣品建庫的實(shí)驗(yàn)要求。RNA質(zhì)檢結(jié)果如表所示：表3.3.2RNA樣品質(zhì)檢結(jié)果No.SmaplenameA260/280A260/230μg/μl[Nanodrop]μg/μl[Qubit]Amountμg質(zhì)量描述1MCMV11.962.040.9620.54413.3合格2MCMV21.992.071.0400.56813.9合格3MCMV31.951.980.9460.50012.2合格4MCEC11.951.830.5640.3007.2合格5MCEC21.992.000.6260.3328.0合格6MCEC31.952.110.6500.3508.4合格圖3.3RNA樣品電泳結(jié)果圖中1-3泳道是實(shí)驗(yàn)組MCMV感染72h的小鼠耳蝸感覺上皮細(xì)胞的總RNA的三組生物學(xué)重復(fù)，4-6泳道是未感染對(duì)照組的總RNA三組生物學(xué)重復(fù)，順序與如上表格序號(hào)順序一致，M泳道為標(biāo)準(zhǔn)陽性對(duì)照HelaCellControlRNA。3.4測(cè)序文庫構(gòu)建及測(cè)序數(shù)據(jù)質(zhì)檢結(jié)果分別構(gòu)建小RNA文庫和鏈特異性文庫，小RNA文庫主峰特異且無雜峰，長(zhǎng)度在150bp左右。鏈特異性文庫主峰特異且無雜峰，主峰長(zhǎng)度在500bp左右，均達(dá)

【參考文獻(xiàn)】：
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本文編號(hào)：3384860