本文關(guān)鍵詞：載BMP-2多肽P24的磷酸鈣骨水泥微球支架材料的骨修復(fù)研究

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【摘要】：大范圍骨缺損通常由外傷、畸形和骨腫瘤等致病因素導(dǎo)致。自體骨移植和異體骨移植是臨床上治療骨缺損的常用方法,然而,由于骨移植物來(lái)源有限、供骨區(qū)并發(fā)癥、感染、排斥反應(yīng)等原因,其應(yīng)用受到限制。在骨組織工程領(lǐng)域,已經(jīng)有很多骨組織工程支架制備出來(lái),但這些支架材料還未能進(jìn)入臨床應(yīng)用,主要是因?yàn)槟壳暗牟牧蠘?gòu)建方案還不能達(dá)到骨組織工程的金標(biāo)準(zhǔn)。因此,制備一種可以在生物層面和結(jié)構(gòu)層面模擬天然骨基質(zhì)的生物材料是十分必要的。磷酸鈣骨水泥(calcium phosphate cememt, CPC)復(fù)合材料是一種新型自固化人工骨替代材料,它是由磷酸鹽粉末與生理鹽水等液體,按照一定比例混合后制備而來(lái)。在植入人體內(nèi)后,磷酸鈣骨水泥可被生理性降解,其降解的終產(chǎn)物是羥基磷灰石(HA)結(jié)晶。目前,CPC憑借其良好的生物相容性、骨傳導(dǎo)性、可塑形性及聚合不放熱等優(yōu)點(diǎn)而獲得青睞,成為骨外科應(yīng)用廣泛的骨填充材料之一。另外,磷酸鈣骨水泥材料還可以作為生長(zhǎng)因子的載體,它可以與抗生素、藥物、生長(zhǎng)因子復(fù)合,在局部實(shí)現(xiàn)其特定的生物效果,已有的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)磷酸鈣骨水泥材料能夠產(chǎn)生良好的組織反應(yīng)。因此,磷酸鈣骨水泥材料是一種極具應(yīng)用前景的骨水泥生物骨修復(fù)材料。將生物活性大分子和支架結(jié)合似乎是一種較好的骨修復(fù)策略,其中一種骨組織工程策略就是應(yīng)用骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2(BMP-2)來(lái)獲得材料的骨誘導(dǎo)性,促進(jìn)極量骨缺損的修復(fù)。1982年,Urist首次在牛骨中提取出活性骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)。骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2(BMP-2)是目前唯一能單獨(dú)誘導(dǎo)異位成骨和單獨(dú)促進(jìn)骨缺損愈合修復(fù)的骨分化生長(zhǎng)因子,其中BMP-2誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨方向定向分化的能力最強(qiáng)。天然骨中含有的BMP-2量很有限,但研究人員已經(jīng)通過(guò)基因工程技術(shù)解決了這一問(wèn)題,制備出重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2 (rhBMP-2)。目前,重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2(rhBMP-2)應(yīng)用缺陷包括：制備工藝復(fù)雜、多重生物學(xué)效應(yīng)、生物學(xué)活性低、半衰期短、缺乏親骨性等。研究發(fā)現(xiàn),在天然人BMP-2成熟肽的114個(gè)氨基酸中,核心結(jié)構(gòu)域是由5-20個(gè)氨基酸組成的,是真正發(fā)揮骨誘導(dǎo)作用結(jié)構(gòu)。P24多肽來(lái)源于BMP-2的“指節(jié)簇”,可極大地發(fā)揮BMP-2的生物學(xué)作用。P24與BMP-2不僅僅是肽鏈長(zhǎng)短之別,獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)表現(xiàn)諸多方面在：1)大規(guī)模合成；2)線性結(jié)構(gòu),活性位點(diǎn)更能充分暴露,生物學(xué)活性高,穩(wěn)定性好；3)作用專(zhuān)一,副作用�。�4)免疫原性低；5)無(wú)破骨活化作用；6)易于表面修飾。P24多肽已被證實(shí)能夠調(diào)控骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)的增殖和分化,誘導(dǎo)體內(nèi)異位成骨。除此之外,P24多肽含有天門(mén)冬氨酸和磷酸化的絲氨酸,它們可以形成酸性環(huán)境,促進(jìn)鈣磷離子沉積,加速晶核形成與礦化過(guò)程。將具有成骨誘導(dǎo)活性的生長(zhǎng)因子與性能良好的載體支架材料復(fù)合可以達(dá)到良好的控釋效果。目前構(gòu)建因子控釋材料的方法主要有兩種,一種是化學(xué)交聯(lián)法,另一種是物理吸附法�；瘜W(xué)交聯(lián)法是指在將支架材料與活性因子以化學(xué)共價(jià)鍵結(jié)合,通常需要在材料加工過(guò)程中添加活性因子,使之在材料中均勻分布,實(shí)現(xiàn)緩釋目的；但是,由于在支架制備的過(guò)程需要使用多種有機(jī)溶劑,活性因子難免會(huì)直接接觸到有機(jī)溶劑,大大削弱其生物學(xué)活性；物理吸附法則完全不同,它是指將已經(jīng)制備好的支架與因子一起浸泡在液體中,一段時(shí)間以后,活性因子便吸附于材料表面或者浸入材料內(nèi)部,從而達(dá)到載藥的目的,這種方法的處理過(guò)程較化學(xué)交聯(lián)法簡(jiǎn)單,能夠最大程度地保留因子的生物活性,但其缺點(diǎn)也比較明顯,即因子在支架材料內(nèi)的分布可能不夠均勻,因子釋放速度往往較快,不能最大限度的發(fā)揮其正常生物學(xué)功能。在眾多的組織工程支架材料之中,微球是一種良好的三維支架材料,將其植入到損傷的組織處,例如,骨缺損部位,能夠支持細(xì)胞擴(kuò)增和細(xì)胞分化,從而修復(fù)組織損傷。微球材料還能用來(lái)作為細(xì)胞的載體,提升細(xì)胞的粘附、增殖、遷移性能,從而極大地促進(jìn)骨缺損修復(fù)。許多球狀生物材料,如磷酸鈣生物材料,都含有活性陶瓷微粒,這些活性物能夠影響其體內(nèi)的骨形成性能；另外,球狀形貌對(duì)于提高材料的載生物活性因子和細(xì)胞性能十分重要。目前,已經(jīng)有很多研究顯示多孔或空心的磷酸鈣微球是一種有效的藥物遞送系統(tǒng)和骨缺損填充物。目的：將P24多肽與磷酸鈣骨水泥微球復(fù)合,制備出新型載P24多肽的磷酸鈣骨水泥微球支架材料,研究該微球材料的因子釋放特點(diǎn),體外細(xì)胞相容性、體外成骨誘導(dǎo)性能、體內(nèi)生物相容性和骨修復(fù)性能,旨在根據(jù)骨組織工程的應(yīng)用策略,尋找合適的生物活性因子,促進(jìn)骨組織工程骨填充復(fù)合材料的發(fā)展,為進(jìn)一步的臨床應(yīng)用提供理論借鑒。方法：本研究采用四鈣磷酸鹽和無(wú)水磷酸氫鈣制備磷酸鈣骨水泥,使用的P24多肽來(lái)源于骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2,其多肽序列為(N→C:KIPKA SSVPT ELSAI STLYL SGGC).首先將P24溶解于鹽酸溶液(0.1 M)中,加入磷酸鈣粉末并持續(xù)攪拌直至混合均勻,采用液滴冷凝法制備出微球,再將微球置入微型球形模具中,采用冷凍干燥法進(jìn)行干燥處理(-50℃,20 Pa)即得到P24/CPC微球。采用此法制備不同P24含量的磷酸鈣骨水泥微球支架材料(P24/CPC質(zhì)量比為0%、2%和4%)--CPC、2% P24/CPC和4% P24/CPC,用于后續(xù)的體內(nèi)體外研究。在體外,采用高性能液相色譜系統(tǒng)檢測(cè)P24/CPC微球的P24多肽釋放性能。將大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞接種于CPC、2% P24/CPC及4% P24/CPC微球支架材料上,置于DMEM培養(yǎng)基中(15%胎牛血清,1%青鏈霉素混合液)共培養(yǎng),分別被采用掃描電鏡、CCK-8法及DAPI熒光標(biāo)記法檢測(cè)細(xì)胞形態(tài)及增殖情況；采用qPCR檢測(cè)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞中的成骨特異性基因(OCN和Runx2)的表達(dá)情況；檢測(cè)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞中堿性磷酸酶活性。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)包括大鼠異位成骨實(shí)驗(yàn)和兔股骨缺損骨修復(fù)實(shí)驗(yàn)兩部分。首先,18只健康雌性SD大鼠(平均重量150 g,購(gòu)于廣東省動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心), 隨機(jī)分成A、B、C三組,每組6只,按照分組分別將CPC、2% P24/CPC及4% P24/CPC微球支架材料植入到大鼠背部豎脊肌肌袋內(nèi),術(shù)后4周、8周行電子計(jì)算機(jī)斷層掃描(CT), 蘇木質(zhì)伊紅染色(HE染色)以及曼森染色檢測(cè)。最后,制備新西蘭大白兔股骨髁圓柱形股缺損模型,將CPC、2% P24/CPC及4% P24/CPC微球支架材料植入到骨缺損處,術(shù)后4周、8周、12周取股骨標(biāo)本,行電子計(jì)算機(jī)斷層掃描(CT)和組織學(xué)檢測(cè),評(píng)估P24/CPC微球材料的骨修復(fù)性能。本研究所得的數(shù)據(jù)均為計(jì)量資料,所有數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±SD)的形式來(lái)表示,在數(shù)據(jù)整理后,采用SPSS20.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析選用析因分析或重復(fù)測(cè)量的方差分析進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理,根據(jù)方差齊性檢驗(yàn)(Levene's檢驗(yàn))結(jié)果選擇校正或不校正的F值和P值。對(duì)多因素?cái)?shù)據(jù)中的某因素組間進(jìn)行比較,兩組之間的比較采用t檢驗(yàn),多組之間的比較采用單因素方差分析(One-Way ANOVA)及LSD多重比較,以P0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果：體外實(shí)驗(yàn)表明P24/CPC微球能夠保持P24多肽活性,并且持續(xù)釋放P24多肽超過(guò)39天。與對(duì)照組相比較,不同P24含量的磷酸鈣骨水泥微球(P24/CPC質(zhì)量比為2%和4%)能夠較好地支持大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)的生長(zhǎng)、增殖及材料表面粘附,增加細(xì)胞的堿性磷酸酶活性及提高成骨特異性基因(OCN和Runx2)的表達(dá)(P0.05)。體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)P24/CPC微球材料具備良好的細(xì)胞相容性,可以顯著促進(jìn)BMSCs的成骨分化。異位成骨實(shí)驗(yàn)中,CT結(jié)果提示,在術(shù)后4周,4%P24/CPC微球材料組大鼠背部組織標(biāo)本的骨密度顯著高于其他組(P0.05)；術(shù)后8周,A、B、C三組的大鼠背部組織標(biāo)本骨密度(BMD)值均有顯著提高(P0.05)；組織學(xué)檢測(cè)表明,CPC、2% P24/CPC及4% P24/CPC微球支架材料體內(nèi)降解性能良好,術(shù)后4周、8周三組微球材料內(nèi)部均有血管長(zhǎng)入,體內(nèi)炎癥反應(yīng)輕微,P24/CPC微球支架材料異位成骨程度顯著高于單純CPC微球支架材料。最后,兔股骨骨缺損修復(fù)實(shí)驗(yàn)中,CT結(jié)果表明術(shù)后4周、8周、12周,材料組的骨量(BV)及骨密度(BMD)均高于空白組.(P0.05),4% P24/CPC組的骨量(BV)及骨密度(BMD)高于CPC組(P0.05),術(shù)后12周CPC、2% P24/CPC及4% P24/CPC組股骨缺損基本修復(fù),組織學(xué)檢測(cè)結(jié)果提示CPC及P24/CPC微球降解性能良好,置入部位炎癥反應(yīng)輕微,材料組骨缺損修復(fù)結(jié)果滿意,其中P24/CPC微球材料骨修復(fù)性能最佳。結(jié)論：磷酸鈣骨水泥微球是P24多肽的一種良好載體,磷酸鈣骨水泥微球與P24多肽復(fù)合后可保持多肽的活性,并持續(xù)釋放P24多肽超過(guò)39天。P24多肽無(wú)明顯的細(xì)胞毒性,有助于提升磷酸鈣骨水泥微球的成骨性能,是具有良好生物活性的骨組織工程細(xì)胞因子。P24/CPC微球支架材料具有良好的生物相容性,生物降解性和骨誘導(dǎo)性,能夠促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞體外成骨分化,促進(jìn)體內(nèi)成骨再生,加速體內(nèi)骨修復(fù)過(guò)程,是一種較有潛力的骨組織工程支架材料。
【關(guān)鍵詞】：BMP-2多肽 磷酸鈣骨水泥 微球 成骨 骨再生
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類(lèi)號(hào)】：R318.08;R687
【目錄】：

• 摘要3-8
• ABSTRACT8-15
• 一、引言15-21
• 二、材料與方法21-32
• 三、結(jié)果32-47
• 四、討論47-49
• 五、結(jié)論49-50
• 全文總結(jié)50-52
• 綜述52-66
• 參考文獻(xiàn)66-83
• 中英文縮略對(duì)照表83-84
• 攻讀學(xué)位期間成果84-86
• 致謝86-87

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