本文關(guān)鍵詞：創(chuàng)傷性腦損傷后移植神經(jīng)干細(xì)胞的研究

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【摘要】：背景和目的:日常生活中由于交通事故、生產(chǎn)事故、自然災(zāi)害等常見原因,創(chuàng)傷性腦損傷(traumatic brain injury,TBI)的發(fā)病率一直居高不下,部分患者殘留肢體殘疾、嚴(yán)重者甚至發(fā)生死亡,嚴(yán)重影響著人類的生命健康、生活質(zhì)量和財(cái)產(chǎn)安全。由于神經(jīng)細(xì)胞毀損后自身欠缺再生能力,創(chuàng)傷性腦損傷后的多數(shù)幸存者中會出現(xiàn)神經(jīng)功能的不全或缺失,從而喪失部分或全部的勞動生產(chǎn)能力和生活自理能力,給社會和家庭帶來了龐大的負(fù)擔(dān)。神經(jīng)功能的保護(hù)和修復(fù)作為創(chuàng)傷性腦損傷后臨床治療中的關(guān)鍵所在,一直以來面臨著嚴(yán)峻的挑戰(zhàn),對于傷后出現(xiàn)的神經(jīng)功能障礙尚無特異性明確有效的治療方法。因此需要我們探索新的行之有效的治療方法來改善目前困窘的局面。由于中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷后自身修復(fù)的局限性,人們發(fā)現(xiàn)神經(jīng)干細(xì)胞(neural stem cells,NSCs)后所進(jìn)行的治療作用的研究,讓我們看到了勝利的曙光。目前神經(jīng)干細(xì)胞的體外研究已日趨成熟,嘗試神經(jīng)干細(xì)胞移植治療創(chuàng)傷性腦損傷也得到了越來越多的重視。本研究中從神經(jīng)干細(xì)胞的分離培養(yǎng)入手,在體外對神經(jīng)干細(xì)胞進(jìn)行標(biāo)記、鑒定,研究其增殖能力及誘導(dǎo)分化后的表型特點(diǎn)。在此基礎(chǔ)上將體外標(biāo)記好的神經(jīng)干細(xì)胞移植到模型鼠腦內(nèi),觀察神經(jīng)干細(xì)胞在宿主腦內(nèi)的分布、遷移和分化,從形態(tài)結(jié)構(gòu)和神經(jīng)功能恢復(fù)等方面來評估細(xì)胞移植治療的修復(fù)作用,為腦外傷的治療探索新途徑并提供理論佐證。研究內(nèi)容:1.體外培養(yǎng)神經(jīng)干細(xì)胞的鑒定及誘導(dǎo)分化后的表型特征方法:取1-2d新生昆明小鼠,機(jī)械分離海馬、嗅球組織,并提取其中的細(xì)胞。體外篩選培養(yǎng)3周后,選取穩(wěn)定懸浮的細(xì)胞進(jìn)行BrdU標(biāo)記,進(jìn)行抗BrdU+Nestin+Hochest33258免疫熒光復(fù)合染色鑒定所培養(yǎng)細(xì)胞的類型。體外誘導(dǎo)促使神經(jīng)干細(xì)胞發(fā)生貼壁、分化,對分化產(chǎn)生的子代細(xì)胞進(jìn)行抗BrdU、β-TubulinⅢ、GFAP、Hochest33258免疫熒光復(fù)合染色確定分化表型。2.創(chuàng)傷性腦損傷后移植神經(jīng)干細(xì)胞的研究方法:采取改良的Feeney氏自由落體法撞擊構(gòu)建所需的實(shí)驗(yàn)動物模型,建模后1d進(jìn)行神經(jīng)干細(xì)胞移植,分別在移植當(dāng)天(移植后0d)、移植后3d、移植后7d、移植后14d、移植后21d進(jìn)行神經(jīng)功能損傷程度(NSS)評分及疲勞轉(zhuǎn)棒測試,移植后7d、21d進(jìn)行抗Brdu、Nestin、GFAP、β-TubulinⅢ免疫熒光染色。結(jié)果:1.從新生鼠海馬及嗅球組織提取得到的細(xì)胞經(jīng)連續(xù)傳代培養(yǎng)后可形成穩(wěn)定懸浮的類球形桑葚狀細(xì)胞團(tuán),且抗BrdU+Nestin+Hochest33258免疫熒光復(fù)合染色均呈陽性。所提取的細(xì)胞體外誘導(dǎo)分化后可產(chǎn)生(抗BrdU+β-TubulinⅢ+Hochest33258)陽性、(抗BrdU+GFAP)陽性的子代細(xì)胞。2.移植后7d、14d、21d神經(jīng)干細(xì)胞移植組的NSS評分分別為(10.22±1.42、7.44±1.17、6.22±1.06),對照組的NSS評分分別為(12.44±2.01、9.44±1.91、7.33±1.63),神經(jīng)干細(xì)胞移植組的NSS評分低于對照組,有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05);移植后14d、21d神經(jīng)干細(xì)胞移植組的疲勞轉(zhuǎn)棒時(shí)間分別為(274.21±4.34s、292.88±4.53s),對照組的疲勞轉(zhuǎn)棒時(shí)間分別為(244.32±9.55s、250.48±10.87s),神經(jīng)干細(xì)胞移植組的疲勞轉(zhuǎn)棒時(shí)間長于對照組,有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05);移植后7d腦組織切片行免疫熒光染色發(fā)現(xiàn)BrdU/Nestin雙陽性細(xì)胞局限于移植進(jìn)針的“隧道”,移植后21d腦組織切片行免疫熒光染色在腦損傷區(qū)域及周圍發(fā)現(xiàn)BrdU/GFAP雙陽性細(xì)胞及BrdU/β-TubulinⅢ雙陽性細(xì)胞。結(jié)論:1.新生鼠海馬、嗅球的組織中含有豐富的神經(jīng)干細(xì)胞來源,體外培養(yǎng)的神經(jīng)干細(xì)胞能夠進(jìn)行自我更新、增殖,在傳代培養(yǎng)的過程中多個(gè)單細(xì)胞聚攏抱團(tuán)趨向于形成穩(wěn)定懸浮的神經(jīng)球,經(jīng)體外誘導(dǎo)分化后可見神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細(xì)胞等細(xì)胞表型。2.部分神經(jīng)干細(xì)胞移植入宿主腦內(nèi)后能夠存活、遷移并在受損區(qū)域發(fā)生分化形成星形膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元,在創(chuàng)傷性腦損傷后一定的時(shí)間窗內(nèi)能夠促進(jìn)受損神經(jīng)功能的改善�？傊�,移植的外源性神經(jīng)干細(xì)胞對創(chuàng)傷性腦損傷有一定的修復(fù)作用,但其長遠(yuǎn)的療效及具體的治療機(jī)制仍有待進(jìn)一步的深入研究。
【關(guān)鍵詞】：神經(jīng)干細(xì)胞 創(chuàng)傷性腦損傷 移植 神經(jīng)球 分化 星形膠質(zhì)細(xì)胞 神經(jīng)元
【學(xué)位授予單位】：蘭州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R651.15
【目錄】：

• 中文摘要3-5
• Abstract5-8
• 縮略詞表8-11
• 第一章 神經(jīng)干細(xì)胞體外培養(yǎng)鑒定及誘導(dǎo)分化表型的研究11-21
• 1 引言11
• 2 材料與方法11-14
• 2.1 實(shí)驗(yàn)材料11-12
• 2.1.1 實(shí)驗(yàn)動物11
• 2.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑及設(shè)備11-12
• 2.2 實(shí)驗(yàn)方法12-14
• 2.2.1 原代神經(jīng)干細(xì)胞的提取及體外培養(yǎng)12
• 2.2.2 神經(jīng)干細(xì)胞傳代培養(yǎng)12-13
• 2.2.3 神經(jīng)干細(xì)胞體外標(biāo)記、染色鑒定13
• 2.2.4 神經(jīng)干細(xì)胞體外誘導(dǎo)分化及其分化表型的鑒定13
• 2.2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析13-14
• 3 結(jié)果14-18
• 3.1 NSCs體外培養(yǎng)過程中的形態(tài)變化14
• 3.2 NSCs的染色鑒定14-15
• 3.3 正在分化過程中的神經(jīng)球及其染色15-16
• 3.4 NSCs的分化表型及鑒定16-18
• 3.4.1 NSCs的分化表型16
• 3.4.2 NSCs向神經(jīng)元方向分化的染色鑒定16-17
• 3.4.3 NSCs向星形膠質(zhì)細(xì)胞方向分化的染色鑒定17-18
• 4 討論18-20
• 5 小結(jié)20-21
• 第二章 創(chuàng)傷性腦損傷后移植神經(jīng)干細(xì)胞的研究21-30
• 1 引言21
• 2 材料與方法21-23
• 2.1 實(shí)驗(yàn)材料21
• 2.1.1 實(shí)驗(yàn)動物及分組21
• 2.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑及設(shè)備21
• 2.2 實(shí)驗(yàn)方法21-23
• 2.2.1 構(gòu)建TBI模型及神經(jīng)干細(xì)胞的移植21-22
• 2.2.2 神經(jīng)功能損害評分22-23
• 2.2.3 疲勞轉(zhuǎn)棒測試23
• 2.2.4 免疫熒光染色23
• 2.2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析23
• 3 結(jié)果23-27
• 3.1 TBI模型的構(gòu)建23-24
• 3.2 神經(jīng)行為功能評分24-25
• 3.3 疲勞轉(zhuǎn)棒時(shí)間25-26
• 3.4 免疫熒光染色26-27
• 3.4.1 外源性NSCs在宿主腦內(nèi)的存活26
• 3.4.2 外源性NSCs在宿主腦內(nèi)的遷移、分化26-27
• 4 討論27-30
• 第三章 結(jié)論與不足30-31
• 1 結(jié)論30
• 2 不足30-31
• 參考文獻(xiàn)31-34
• 致謝34-35
• 綜述35-42
• 參考文獻(xiàn)40-42
• 在學(xué)期間的研究成果42

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本文編號：962278