本文關(guān)鍵詞：乳腺癌腦轉(zhuǎn)移細(xì)胞系靶向肽BRBP1受體的尋找與鑒定

  更多相關(guān)文章： 受體 BRBP1-Fc肽體 免疫共沉淀 質(zhì)譜

【摘要】：乳腺癌(Breast cancer)是女性最常見的惡性腫瘤,其發(fā)病率逐年提高,已成為嚴(yán)重威脅女性健康的重大疾病之一。腦轉(zhuǎn)移是乳腺癌患者致死、致殘的重要原因,大約10-30%的散發(fā)性患者會(huì)發(fā)生乳腺癌腦轉(zhuǎn)移(breast cancer brain metastases, BCBM),用標(biāo)準(zhǔn)療法(standard treatments),包括全腦放射治療(whole brain radiotherapy, WBRT)、立體定向放射治療(stereotactic radiosurgery, SRS)和手術(shù)(Surgery),平均中位生存期也只有1年。為此,研究乳腺癌腦轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制,闡明腦轉(zhuǎn)移過程的相關(guān)靶標(biāo)至關(guān)重要。我們實(shí)驗(yàn)室前期利用噬菌體展示肽庫篩選技術(shù)(Phage display technology)對(duì)乳腺癌腦轉(zhuǎn)移細(xì)胞系231-BR進(jìn)行全細(xì)胞消減篩選,成功獲得了與231-BR細(xì)胞系特異性結(jié)合的多肽BRBP1(專利號(hào)：ZL201210538671.4),體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)研究均已證實(shí)該肽與乳腺癌腦轉(zhuǎn)移細(xì)胞系呈現(xiàn)出高親和力結(jié)合,并且基于BRBP1肽構(gòu)建的近紅外熒光成像分子探針可用于腦轉(zhuǎn)移性乳腺癌荷瘤鼠活體近紅外熒光成像,構(gòu)建的BRBP1-TAT-KLA復(fù)合肽可顯著抑制乳腺癌腦轉(zhuǎn)移灶的生成及生長。臨床乳腺癌組織水平的初步研究也顯示其與乳腺癌患者腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移手術(shù)切除標(biāo)本特異性結(jié)合。因此,尋找與BRBP1肽特異結(jié)合的受體對(duì)深度認(rèn)識(shí)BRBP1肽的功能、拓寬BRBP1肽的應(yīng)用價(jià)值、探索乳腺癌腦轉(zhuǎn)移機(jī)制具有重要意義。本研究課題主要內(nèi)容包括以下：1.乳腺癌腦轉(zhuǎn)移細(xì)胞系靶向肽體的表達(dá)與特異性鑒定利用基因重組技術(shù)構(gòu)建pFUSE-hIgG2-Fc2-BRBP 1真核表達(dá)載體,表達(dá)BRBPl-Fc肽體,通過Western blotting實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證蛋白表達(dá)正確,ELISA、流式細(xì)胞術(shù)以及競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合免疫熒光等實(shí)驗(yàn)證實(shí)BRBP1-Fc肽體保留BRBP1肽與231-BR細(xì)胞結(jié)合特性,為尋找BRBP1肽的受體以及進(jìn)一步研究BRBP1的生物學(xué)功能奠定基礎(chǔ)。2.免疫(共)沉淀方法對(duì)BRBP1肽特異性受體的尋找與鑒定目前尋找受體的方法有多種,但是并無普遍適用且保證成功的方法可遵循。本研究采用免疫(共)沉淀的方法尋找BRBP1肽的受體。即利用真核表達(dá)的BRBP1-Fc肽體和Protein G磁珠相互作用,合成BRBP1-BIOTIN生物素肽和鏈霉親和素磁珠相互作用,通過免疫(共)沉淀的方法捕獲與之相互作用的蛋白。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)嚴(yán)謹(jǐn)?shù)膶?duì)照,借助銀染方法尋找差異性條帶,通過串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)分析具體蛋白分子。差異表達(dá)蛋白共有24個(gè),我們首先分析兩次質(zhì)譜結(jié)果共有的Annexin A2分子,通過細(xì)胞免疫熒光實(shí)驗(yàn)證實(shí)其在231-BR、MDA-MB-231、MCF-7細(xì)胞表面的表達(dá)情況符合期望受體分布,繼而通過siRNA、免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)研究Annexin A2是否和BRBP1肽相互作用。但是目前還沒有明確二者的具體關(guān)系,仍有待后續(xù)進(jìn)一步探究。此外,我們通過生物信息學(xué)軟件分析得到3個(gè)候選受體分子(SND1、S100A8, AP2B1),需要后期實(shí)驗(yàn)證明。3.基于數(shù)據(jù)庫生物信息學(xué)分析篩選BRBP1肽的受體Matthew D. Dun等研究者就乳腺癌腦轉(zhuǎn)移細(xì)胞231-BR和乳腺癌親代細(xì)胞MDA-MB-231細(xì)胞在protein、nmRNA、miRNA層面的差異做了綜合、系統(tǒng)、全面、前沿的分析。Riesa M. B.等橫向進(jìn)行了乳腺癌腦轉(zhuǎn)移細(xì)胞(231-BR)、肺轉(zhuǎn)移細(xì)胞(LMD-231)、骨轉(zhuǎn)移細(xì)胞(BMD-231)、腎上腺轉(zhuǎn)移細(xì)胞(ADMD-231)以及乳腺癌親代細(xì)胞(MD-231P)的基因芯片技術(shù)。通過檢索相關(guān)數(shù)據(jù)庫,我們共得到5個(gè)在231-BR細(xì)胞上調(diào)的膜分子,聯(lián)合MCF-7細(xì)胞為對(duì)照,通過定量PCR技術(shù)初步篩選,發(fā)現(xiàn)相較于MDA-MB-231、MCF-7細(xì)胞,Moesin分子在231-BR細(xì)胞明顯高表達(dá)。隨后我們又通過Western blotting、細(xì)胞免疫熒光、流式細(xì)胞術(shù)實(shí)驗(yàn)證實(shí)Moesin分子表達(dá)情況符合期望受體分布。繼而我們通過siRNA干擾實(shí)驗(yàn)研究Moesin分子和BRBP1肽相互作用情況。目前,我們已通過干擾實(shí)驗(yàn)初步確定二者的配受體關(guān)系。本研究的核心內(nèi)容即為尋找靶向乳腺癌腦轉(zhuǎn)移細(xì)胞系多肽BRBP1的受體。先后采用了免疫(共)沉淀-質(zhì)譜分析、數(shù)據(jù)庫篩查的方法。通過數(shù)據(jù)庫篩查法所獲得Moesin分子已初步證實(shí)和BRBP1肽的相互作用,通過質(zhì)譜確立的候選分子需要后期進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)鑒定研究。
【關(guān)鍵詞】：受體 BRBP1-Fc肽體 免疫共沉淀 質(zhì)譜
【學(xué)位授予單位】：東南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R737.9
【目錄】：

• 中文摘要5-7
• 英文摘要7-11
• 主要英文縮寫詞表11-14
• 前言14-16
• 第一章 文獻(xiàn)綜述 乳腺癌腦轉(zhuǎn)移發(fā)生機(jī)制及相關(guān)治療的研究進(jìn)展16-30
• 第二章 乳腺癌腦轉(zhuǎn)移細(xì)胞系靶向肽體的表達(dá)與特異性鑒定30-43
• 1. 材料和試劑30-33
• 2. 實(shí)驗(yàn)方法33-38
• 3. 結(jié)果38-41
• 4. 討論41-43
• 第三章 免疫(共)沉淀方法對(duì)BRBP1肽特異性受體的尋找與鑒定43-67
• 第一節(jié) 免疫(共)沉淀法尋找BRBP1肽特異性結(jié)合受體43-53
• 1. 材料和試劑43-45
• 2. 實(shí)驗(yàn)方法45-49
• 3. 結(jié)果49-51
• 4. 討論51-53
• 第二節(jié) 質(zhì)譜技術(shù)聯(lián)合生物信息學(xué)分析候選受體53-58
• 1. 材料和試劑53
• 2. 實(shí)驗(yàn)方法53-54
• 3 結(jié)果54-57
• 4. 討論57-58
• 第三節(jié) BRBP1肽候選受體的驗(yàn)證58-67
• 1. 材料和試劑58-60
• 2. 實(shí)驗(yàn)方法60-62
• 3. 結(jié)果62-65
• 4 討論65-67
• 第四章 基于數(shù)據(jù)庫生物信息學(xué)分析篩選BRBP1肽的受體67-79
• 1. 材料和試劑67-68
• 2. 實(shí)驗(yàn)方法68-72
• 3. 結(jié)果72-76
• 4. 討論76-79
• 小結(jié)與展望79-80
• References80-86
• 作者簡(jiǎn)介86
• 碩士期間發(fā)表論文86
• 碩士期間參加的會(huì)議86-87
• 致謝87

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本文編號(hào)：903019