本文關(guān)鍵詞：應(yīng)用肥大化軟骨細(xì)胞和海藻酸鈉復(fù)合物栓塞治療動(dòng)靜脈畸形的研究

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【摘要】：動(dòng)靜脈畸形(arteriovenous malformation,AVM)是一種常見的先天性血管發(fā)育異常,動(dòng)靜脈直接相通,其間無毛細(xì)血管,從而導(dǎo)致一系列血流動(dòng)力學(xué)紊亂。常見于20~40歲的青壯年。目前,動(dòng)靜脈畸形的治療方法主要包括外科手術(shù)、放射治療以及血管內(nèi)的介入治療。隨著科技的發(fā)展與進(jìn)步,近年來血管內(nèi)治療由于具有創(chuàng)傷小這一顯著特點(diǎn),得到了較快的發(fā)展。血管內(nèi)栓塞材料的不斷開發(fā)和研究,使血管內(nèi)栓塞治療逐漸成為主要的治療動(dòng)靜脈畸形的手段。而栓塞治療的主要制約條件就是栓塞材料。目前國(guó)內(nèi)外的栓塞材料主要包括顆粒栓塞材料、粘附性栓塞材料及非粘附性栓塞材料,這三類栓塞材料分別都有其不足之處。海藻酸鈉是從海帶中提取的天然聚合物多糖,具有良好的水溶性,與二價(jià)鈣離子接觸后,形成具有一定強(qiáng)度的海藻凝膠。具有良好的生物相容性,同時(shí)具有良好的彌散性,隨著時(shí)間推移,逐步降解為無毒的多糖,隨尿液排出體外。由于海藻凝膠具有降解的性質(zhì),不能永久保證栓塞的效果,我們把目光轉(zhuǎn)向細(xì)胞與海藻凝膠結(jié)合,在海藻降解的同時(shí)細(xì)胞增殖,從而保證了長(zhǎng)久的栓塞可能。目前主要的細(xì)胞來源為成纖維細(xì)胞及骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞:成纖維細(xì)胞來源豐富,增殖能力強(qiáng),但其基質(zhì)分泌能力較差,不利于細(xì)胞存活;骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞具有多向分化潛能及良好的自我更新能力,但其含量較少,擴(kuò)增不易。軟骨細(xì)胞是軟骨組織中特有且唯一的細(xì)胞,其具有一定的力學(xué)強(qiáng)度,能夠分泌大量的基質(zhì)成分,在缺氧的條件下能夠生存。肥大化是軟骨內(nèi)骨化一個(gè)關(guān)鍵的生理步驟,肥大化軟骨細(xì)胞逐漸骨化形成的鈣化物可以進(jìn)一步增大細(xì)胞的強(qiáng)度,同時(shí)肥大化軟骨可以分泌VEGF等生長(zhǎng)因子,促進(jìn)細(xì)胞增殖和生長(zhǎng)。因此,本實(shí)驗(yàn)中我們選擇肥大化的軟骨細(xì)胞與海藻凝膠結(jié)合形成復(fù)合物,作為治療動(dòng)靜脈畸形的栓塞材料。在本實(shí)驗(yàn)中,我們采用兔肋軟骨細(xì)胞原代培養(yǎng)分別得到1代、3代及5代的軟骨細(xì)胞,通過測(cè)定細(xì)胞的生長(zhǎng)速度,得到最適合實(shí)驗(yàn)的細(xì)胞代次,即第3代的軟骨細(xì)胞,同時(shí)將細(xì)胞進(jìn)行肥大化處理后的各個(gè)標(biāo)志性基因進(jìn)行鑒定。接著通過實(shí)驗(yàn)得出海藻酸鈉及Ca Cl2的最適濃度,然后將肥大化的軟骨細(xì)胞與海藻凝膠混合,得到海藻凝膠與細(xì)胞復(fù)合物,在體外培養(yǎng)1月后檢測(cè)細(xì)胞存活率。之后將海藻凝膠-細(xì)胞復(fù)合物移植至裸鼠體內(nèi)分析海藻凝膠-細(xì)胞復(fù)合物的穩(wěn)定性。最后將海藻酸鈉細(xì)胞混合物和Ca Cl2經(jīng)雙導(dǎo)管注入實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭?驗(yàn)證海藻凝膠-細(xì)胞復(fù)合物作為治療動(dòng)靜脈畸形的血管內(nèi)栓塞材料的可行性。本研究取得如下結(jié)果:1.成功分離了原代的軟骨細(xì)胞,根據(jù)P1、P3及P5代次細(xì)胞的生存曲線狀態(tài),選定了P3代細(xì)胞作為細(xì)胞來源。2.P3代細(xì)胞進(jìn)行肥大化處理后,其Ⅱ型膠原含量基本保持不變;同時(shí),肥大化軟骨細(xì)胞的標(biāo)志性基因X型膠原開始出現(xiàn),并隨著肥大化進(jìn)程逐步增多;細(xì)胞外基質(zhì)分泌增多。3.選取了2%的海藻酸鈉與6%的Ca Cl2為最適的濃度比例,并將細(xì)胞移植至海藻凝膠中,細(xì)胞在其中生存狀況良好,顯示了良好的細(xì)胞活力。4.將種植種子細(xì)胞的海藻酸鹽-細(xì)胞復(fù)合物移植至裸鼠體內(nèi)1個(gè)月,取材分析,海藻凝膠體積基本不變,同時(shí)裸鼠未見明顯的炎癥現(xiàn)象。5.初步制備了腎動(dòng)脈栓塞模型,將海藻酸鈉-細(xì)胞混合物與Ca Cl2同時(shí)注入兔腎動(dòng)脈內(nèi),成功地栓塞了右側(cè)腎動(dòng)脈,超聲及核磁共振檢查顯示,經(jīng)過2個(gè)月的栓塞,右側(cè)腎未見明顯血流,同時(shí)伴有右側(cè)腎臟的明顯萎縮。以上研究結(jié)果為進(jìn)一步探索動(dòng)靜脈畸形栓塞材料提供了初步的實(shí)驗(yàn)參考。
【關(guān)鍵詞】：肥大化軟骨細(xì)胞 海藻凝膠 栓塞材料
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R654.4
【目錄】：

• 摘要4-6
• Abstract6-11
• 第1章 緒論11-20
• 1.1 動(dòng)靜脈畸形11-13
• 1.1.1 動(dòng)靜脈畸形好發(fā)部位11-12
• 1.1.2 動(dòng)靜脈畸形的診斷方法12
• 1.1.3 動(dòng)靜脈畸形的治療措施12-13
• 1.2 目前應(yīng)用的栓塞材料13-17
• 1.2.1 固體栓塞材料13-14
• 1.2.2 粘附性液體栓塞材料14
• 1.2.3 非粘附性液體栓塞材料（沉淀聚合物）14-15
• 1.2.4 水凝膠栓塞材料15-17
• 1.3 種子細(xì)胞來源17-20
• 1.3.1 成纖維細(xì)胞17
• 1.3.2 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞17-18
• 1.3.3 軟骨細(xì)胞18
• 1.3.4 肥大化軟骨細(xì)胞18-20
• 第2章 材料與方法20-27
• 2.1 實(shí)驗(yàn)材料20-22
• 2.1.1 實(shí)驗(yàn)儀器和設(shè)備20-21
• 2.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑21
• 2.1.3 主要試劑的配制21-22
• 2.1.4 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物22
• 2.2 實(shí)驗(yàn)方法22-27
• 2.2.1 細(xì)胞分離和培養(yǎng)22-23
• 2.2.2 細(xì)胞生長(zhǎng)曲線23
• 2.2.3 細(xì)胞肥大化誘導(dǎo)23
• 2.2.4 Alcian Blue染色23
• 2.2.5 細(xì)胞免疫熒光檢測(cè)23-24
• 2.2.6 海藻凝膠的制備24
• 2.2.7 細(xì)胞活力檢測(cè)24
• 2.2.8 RNA提取及RT-PCR24-26
• 2.2.9 裸鼠皮下移植26
• 2.2.10 兔腎動(dòng)脈栓塞實(shí)驗(yàn)26
• 2.2.11 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析26-27
• 第3章 實(shí)驗(yàn)結(jié)果27-36
• 3.1 軟骨細(xì)胞生長(zhǎng)狀況27-31
• 3.1.1 P1、P3、P5代軟骨細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線27
• 3.1.2 軟骨細(xì)胞的肥大化誘導(dǎo)27-29
• 3.1.3 肥大化軟骨細(xì)胞的鑒定29-31
• 3.2 海藻凝膠的濃度篩選31-32
• 3.2.1 海藻酸鈉濃度的選定31
• 3.2.2 CaCl_2濃度的選定31-32
• 3.3 海藻凝膠-細(xì)胞復(fù)合物32-34
• 3.3.1 細(xì)胞在海藻凝膠中的狀態(tài)32
• 3.3.2 海藻凝膠中細(xì)胞的活力檢測(cè)32-33
• 3.3.3 海藻凝膠-細(xì)胞復(fù)合物的生物相容性檢測(cè)33-34
• 3.4 兔腎動(dòng)脈栓塞實(shí)驗(yàn)34-36
• 討論36-38
• 結(jié)論38-39
• 參考文獻(xiàn)39-44
• 作者簡(jiǎn)介44-45
• 致謝45

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