本文關(guān)鍵詞：富氫培養(yǎng)液對脂多糖所致離體人腸上皮屏障功能障礙的影響及機(jī)制研究

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【摘要】：目的:膿毒癥是由感染因素誘發(fā)并且以炎性反應(yīng)為主的綜合征,是燒傷、創(chuàng)傷和大手術(shù)等的常見并發(fā)癥。腸上皮屏障能夠阻擋微生物、毒素等透過腸壁進(jìn)入人體內(nèi)其他組織、器官以及血液循環(huán)。腸屏障功能障礙是膿毒癥引發(fā)多器官功能障礙綜合征(MODS)的重要因素。緊密連接蛋白o(hù)ccludin與黏附連接蛋白E-cadherin是腸上皮屏障的主要組成成分。內(nèi)毒素脂多糖(LPS)通過改變緊密連接蛋白和黏附連接蛋白的正常表達(dá),造成腸上皮屏障通透性增加,引發(fā)腸屏障功能障礙。多項(xiàng)研究已經(jīng)證實(shí)氫氣對多種膿毒癥動物模型具有明確的保護(hù)作用,但是其具體機(jī)制尚未明確。本實(shí)驗(yàn)研究擬運(yùn)用人結(jié)腸腺癌細(xì)胞系建立離體人腸屏障功能障礙模型,觀察富氫培養(yǎng)液在調(diào)節(jié)LPS誘發(fā)的腸屏障功能障礙中的作用,并深入探討其相關(guān)的作用機(jī)制。方法:人結(jié)腸腺癌細(xì)胞系Caco2復(fù)蘇后傳代培養(yǎng)至第28-35代之間時(shí)用于實(shí)驗(yàn)。第一部分:建立Caco2細(xì)胞單層模型。首先分別采用不同濃度的LPS(1,10,100μg/ml和1 mg/ml)孵育,于不同時(shí)間點(diǎn)(0,3,6,12,24,48 h)檢測跨上皮電阻(TER)值和異硫氰酸熒光素標(biāo)記的葡聚糖的滲透系數(shù)(PE)。采用CCK-8法測定100μg/ml和1 mg/ml的LPS對Caco2細(xì)胞增殖活力的影響。隨機(jī)將細(xì)胞進(jìn)行分組(4組):對照(control)組、富氫培養(yǎng)液(H2)組、脂多糖(LPS)組和LPS+H2組。按分組處理,于孵24 h時(shí),分別檢測TER值和PE。分別于孵育6、12和24 h時(shí),采用Western blot法測定occludin與E-cadherin的表達(dá)水平;于孵育24 h時(shí),采用免疫熒光法測定occludin與E-cadherin的分布情況。第二部分:首先按照第一部分的分組方法于孵育24h時(shí),采用GST-Pulldown法測定Caco2細(xì)胞中Ras同源家族蛋白A(Rho A)的活性。細(xì)胞進(jìn)行隨機(jī)分組(5組):control組、LPS組、LPS+H2組、LPS+H 2+Rho A激動劑CN03(LPS+H2+CN03)組、LPS+Rho A抑制劑C3胞外酶(LPS+C3)組。Control組、LPS組以及LPS+H2組處理同第一部分。LPS+H2+CN03組中,于孵育前3 h時(shí)加入1μg/ml的CN03。LPS+C3組中,于孵育前1 h時(shí)加入2.5μg/ml的C3胞外酶。于孵育24 h時(shí)測定腸屏障模型的TER值與PE。分別采用Western blot法和免疫熒光法測定occludin與E-cadherin的表達(dá)與分布情況。第三部分:首先按照第一部分的分組方法于孵育24h時(shí),Western blot法測定哺乳動物Diaphanous相關(guān)成蛋白1(m Dia1)的表達(dá)水平。慢病毒法轉(zhuǎn)染Caco2細(xì)胞,對m Dia1進(jìn)行RNA干擾,并獲取穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株。將細(xì)胞隨機(jī)分為5組:control組、LPS組、RNA干擾(si RNA m Dia1)組、LPS+H2組和si RNA m Dia1+LPS+H2組。其中,control組、LPS組和LPS+H2組處理同前;si RNA m Dia1組和si RNA m Dia1+LPS+H2組使用穩(wěn)定表達(dá)m Dia1干擾片段的Caco2細(xì)胞。于孵育24 h時(shí)測定腸屏障模型的TER值與PE。分別采用Western blot法和免疫熒光法測定occludin與E-cadherin的表達(dá)與分布情況。結(jié)果:第一部分:與0μg/ml LPS組比較,100μg/ml和1 mg/ml的LPS孵育6-48h的時(shí)間范圍內(nèi),TER值下降且PE均降低升高,趨勢呈現(xiàn)出時(shí)間依賴性,并且在24 h時(shí)變化程度最為明顯;100μg/ml LPS對細(xì)胞活力無顯著影響,而1mg/ml LPS組中細(xì)胞活力顯著降低。Control組與H2組比較,上述各指標(biāo)間差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與control組比較,在LPS組孵育24 h時(shí)腸屏障模型的TER值降低,PE升高;孵育6-24 h時(shí),occludin和E-cadherin的表達(dá)均下調(diào);孵育24 h時(shí),occludin和E-cadherin在細(xì)胞膜處分布減少,在細(xì)胞質(zhì)中分布增多,“鐵絲網(wǎng)”樣形態(tài)的連續(xù)性與完整性破壞。與LPS組比較,LPS+H2組孵育24 h時(shí)腸屏障模型的TER值升高,PE降低;孵育6-24 h時(shí),occludin和E-cadherin的表達(dá)均上調(diào);孵育24 h時(shí),occludin和E-cadherin在細(xì)胞膜處分布增多,在細(xì)胞質(zhì)中分布減少,“鐵絲網(wǎng)”樣形態(tài)的連續(xù)性與完整性改善。第二部分:與control組比較,LPS組中Rho A活性升高;與LPS組比較,LPS+H2組中Rho A活性降低。與LPS+H2組比較,LPS+H2+CN03組中TER值降低且PE升高,occludin和E-cadherin表達(dá)下調(diào),且分布紊亂。與LPS組比較,LPS+C3組中,TER值升高且PE降低,occludin和E-cadherin的表達(dá)上調(diào),分布情況改善。第三部分:與control組比較,LPS組m Dia1表達(dá)降低,LPS+H2組m Dia1表達(dá)升高。與control組比較,si RNA m Dia1組TER值降低且PE升高,occludin和E-cadherin表達(dá)下調(diào),且分布紊亂;與LPS+H2組比較,si RNA m Dia1+LPS+H2組TER值降低且PE升高,occludin和E-cadherin表達(dá)下調(diào),且分布紊亂。結(jié)論:富氫培養(yǎng)液能夠改善LPS所致離體人腸屏障模型的通透性異常增加,并能調(diào)節(jié)緊密連接蛋白o(hù)ccludin和黏附連接蛋白E-cadherin的表達(dá)與分布,體現(xiàn)了腸屏障保護(hù)效應(yīng),其機(jī)制可能與調(diào)節(jié)Rho A-m Dia1通路的表達(dá)水平有關(guān)。
【關(guān)鍵詞】：膿毒癥 富氫培養(yǎng)液 脂多糖 腸屏障 Ras同源家族蛋白 A(RhoA) 哺乳動物Diaphanous相關(guān)成蛋白1(mDia1)
【學(xué)位授予單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R614
【目錄】：

• 中文摘要4-7
• Abstract7-12
• 縮略語/符號說明12-15
• 前言15-18
• 研究現(xiàn)狀、成果15-17
• 研究目的、方法17-18
• 一、富氫培養(yǎng)液在調(diào)節(jié)LPS誘發(fā)離體人腸屏障功能障礙中的作用18-42
• 1.1 對象和方法18-28
• 1.1.1 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞18
• 1.1.2 實(shí)驗(yàn)儀器與耗材18-19
• 1.1.3 主要試劑19-20
• 1.1.4 主要溶液配制20-21
• 1.1.5 實(shí)驗(yàn)方法與步驟21-27
• 1.1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析與處理27-28
• 1.2 結(jié)果28-36
• 1.2.1 不同濃度的LPS對離體人腸屏障TER值的影響28-29
• 1.2.2 不同濃度的LPS對離體人腸屏障滲透系數(shù)PE的影響29-30
• 1.2.3 不同濃度的LPS對Caco2細(xì)胞增殖活性的影響30-31
• 1.2.4 富氫培養(yǎng)液對LPS刺激離體腸屏障TER值的影響31-32
• 1.2.5 富氫培養(yǎng)液對LPS刺激離體腸屏障滲透系數(shù)PE的影響32-33
• 1.2.6 富氫培養(yǎng)液對LPS刺激所致occludin和E-cadherin表達(dá)水平變化的影響33-34
• 1.2.7 富氫培養(yǎng)液對LPS刺激所致occludin和E-cadherin分布情況的影響34-36
• 1.3 討論36-40
• 1.3.1 腸道上皮屏障與膿毒癥36-37
• 1.3.2 緊密連接蛋白與黏附連接蛋白37-38
• 1.3.3 氫氣的治療效應(yīng)38-40
• 1.4 小結(jié)40-42
• 二、RhoA在富氫培養(yǎng)液改善離體腸屏障功能障礙中的作用42-54
• 2.1 對象和方法42-45
• 2.1.1 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞42
• 2.1.2 實(shí)驗(yàn)儀器與耗材42
• 2.1.3 主要試劑42
• 2.1.4 主要溶液配制42
• 2.1.5 實(shí)驗(yàn)方法與步驟42-44
• 2.1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析與處理44-45
• 2.2 結(jié)果45-50
• 2.2.1 LPS和富氫培養(yǎng)液對Caco2細(xì)胞中RhoA活性的影響45-46
• 2.2.2 Rho A在富氫培養(yǎng)液改善LPS所致腸屏障TER值異常降低中的作用46
• 2.2.3 Rho A在富氫培養(yǎng)液改善LPS所致腸屏障PE值異常升高中的作用46-47
• 2.2.4 RhoA在富氫培養(yǎng)液改善LPS所致腸屏障緊密連接蛋白o(hù)ccludin和黏附連接蛋白E-cadherin表達(dá)水平異常降低中的作用47-48
• 2.2.5 RhoA在富氫培養(yǎng)液改善LPS所致腸屏障occludin和E-cadherin分布狀態(tài)異常中的作用48-50
• 2.3 討論50-52
• RhoA信號蛋白與腸屏障功能障礙50-52
• 2.4 小結(jié)52-54
• 三、哺乳動物diaphanous相關(guān)成蛋白 1（mDia1）在富氫培養(yǎng)液減輕LPS所致離體腸屏障功能障礙中的作用54-69
• 3.1 對象和方法54-59
• 3.1.1 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞54
• 3.1.2 實(shí)驗(yàn)儀器與耗材54
• 3.1.3 主要試劑54
• 3.1.4 主要溶液配制54
• 3.1.5 實(shí)驗(yàn)方法與步驟54-58
• 3.1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析與處理58-59
• 3.2 結(jié)果59-65
• 3.2.1 LPS和富氫培養(yǎng)液對Caco2細(xì)胞中mDia1蛋白表達(dá)水平的影響59
• 3.2.2 慢病毒轉(zhuǎn)染法對Caco2細(xì)胞中mDia1的mRNA表達(dá)水平和蛋白表達(dá)水平的影響59-60
• 3.2.3 mDia1信號蛋白在富氫培養(yǎng)液減輕LPS誘導(dǎo)TER值異常降低中的作用60-61
• 3.2.4 mDia1信號蛋白在富氫培養(yǎng)液減輕LPS誘導(dǎo)PE異常升高中的作用61-62
• 3.2.5 干擾mDia1信號蛋白的表達(dá)對富氫培養(yǎng)液減輕LPS誘導(dǎo)緊密連接蛋occludin和黏附連接蛋白E-cadherin表達(dá)水平異常降低作用的影響62-63
• 3.2.6 干擾mDia1信號蛋白的表達(dá)對富氫培養(yǎng)液減輕LPS誘導(dǎo)緊密連接蛋occludin和黏附連接蛋白E-cadherin分布狀態(tài)異常作用的影響63-65
• 3.3 討論65-68
• 3.3.1 Rho A/mDia1信號通路65-66
• 3.3.2 H_2對膿毒癥相關(guān)信號通路的調(diào)節(jié)作用66-68
• 3.4 小結(jié)68-69
• 結(jié)論69-70
• 參考文獻(xiàn)70-77
• 發(fā)表論文和參加科研情況說明77-79
• 綜述 緊密連接蛋白在維持腸屏障功能中的作用與機(jī)制研究進(jìn)展79-89
• 綜述參考文獻(xiàn)86-89
• 致謝89-91
• 個人簡歷91

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 呂賓;;腸黏膜屏障與腸功能障礙[J];現(xiàn)代消化及介入診療;2013年04期

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本文編號：881158