本文關(guān)鍵詞：構(gòu)建NT-3交聯(lián)脫細胞脊髓支架緩釋系統(tǒng)及研究其體外實驗

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【摘要】：背景:近年來,為了治療脊髓損傷(spinal cord injury,SCI),組織工程學,通過支架材料復(fù)合種子細胞,額外添加營養(yǎng)因子,對脊髓再生進行重構(gòu),從而促進其功能恢復(fù)。其中支架材料可以提供適宜微環(huán)境和一定的機械支撐,促使種子細胞的粘附、生長,在組織工程修復(fù)中具有相當重要作用。目前常用的脊髓支架材料,如:透明質(zhì)酸、PLGA絲蛋白-殼聚糖復(fù)合支架材料等。雖然以上材料具有各自獨特的優(yōu)點,但是它們不具備脊髓特有結(jié)構(gòu),如微觀三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu),因此在脊髓修復(fù)重建中有局限作用。前期研究,脊髓組織被脫細胞,得到ECM三維空間結(jié)構(gòu),膠原、纖維連接蛋白、層粘連蛋白等被保留,即脫細胞脊髓支架材料。但前期的脊髓脫細胞方法尚不穩(wěn)定,主要表現(xiàn)在脫細胞徹底而細胞外基質(zhì)保留不完整,或者細胞外基質(zhì)保留完整而脫細胞不徹底,此外脫細胞脊髓支架復(fù)合種子細胞后還遭遇神經(jīng)營養(yǎng)因子匱乏的難題。因此,進行一下研究:(1)脫細胞方法被優(yōu)化,支架的制備過程被穩(wěn)定化;(2)并采用化學交聯(lián)的方法結(jié)合神經(jīng)營養(yǎng)因子-3(NT-3),使NT-3交聯(lián)脫細胞脊髓支架的緩釋系統(tǒng)具有緩釋活性作用;(3)NT-3交聯(lián)脫細胞脊髓支架復(fù)合種子細胞后具有獨特的作用,可以促進種子細胞粘附、增殖等。目的:1.脫細胞方法被優(yōu)化,脊髓ECM結(jié)構(gòu)被保留,細胞被徹底去除。2.采用碳化二亞胺(EDC)化學交聯(lián)的作用,將NT-3結(jié)合到脫細胞脊髓支架上,制備NT-3交聯(lián)脫細胞脊髓支架的緩釋系統(tǒng),分析該緩釋系統(tǒng)NT-3的緩釋性、緩釋NT-3的生物活性。3.大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞(BMSCs)被復(fù)合NT-3交聯(lián)脫細胞脊髓支架上,支架對BMSCs粘附、增殖的影響。方法:1.傳統(tǒng)法和優(yōu)化法,制備脊髓支架,采用肉眼觀察、掃描電鏡、光鏡、凍干、稱重、酶解等技術(shù)對比研究支架的特性。2.elisa法被用來檢測nt-3緩釋性,緩釋nt-3的生物學活性被e18孕鼠體內(nèi)胚鼠的背根神經(jīng)節(jié)驗證,nt-3交聯(lián)脫細胞脊髓支架整體蛋白分解性被bca蛋白測定法檢測。3.對bmscs進行復(fù)蘇、培養(yǎng)、傳代等操作,得到p3代bmscs,復(fù)合到脫細胞脊髓支架和nt-3交聯(lián)脫細胞脊髓支架后,共培養(yǎng)4小時后采用dapi檢測bmscs在不同支架的粘附性;在不同的時間點,如共培養(yǎng)24小時、48小時后,不同支架對bmscs增殖的影響被cck-8檢測。結(jié)果:1.優(yōu)化組制備的支架“優(yōu)”等級為80%,he評分“優(yōu)”等級的支架經(jīng)過dapi染色,激光共聚焦顯微鏡檢測,內(nèi)部結(jié)構(gòu)脫細胞徹底,評分也為“優(yōu)”等級;電子顯微鏡掃描可見三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu),孔徑平均為31.02um,含水率為(228.14±19.39)%,孔隙率為(71.82±2.10)%;在4、8、12、16、20小時不同時間段的抗酶解性為(8.268±1.229)%、(16.16±1.568)%、(23.5±2.252)%、(28.582±2.243)%、(35.904±1.911)%。優(yōu)化組支架脫細胞徹底,制備效率高,孔徑與傳統(tǒng)組支架相當,但是含水率、孔隙率、抗酶解性均優(yōu)于傳統(tǒng)組支架。2.脫細胞脊髓支架與nt-3通過edc交聯(lián),nt-3交聯(lián)脫細胞脊髓支架被成功構(gòu)建,采用elisa法測定nt-3在不同時間段的緩釋量,緩釋性可達35天,在1、4、7、14、21、28、35天時間段的nt-3緩釋濃度分別為(480.52±69.88)pg/ml、(111.43±5.34)pg/ml、(66.11±17.99)pg/ml、(121.35±7.85)pg/ml、(61.34±9.88)pg/ml、(36.22±16.37)pg/ml、(29.95±12.95)pg/ml;翻倍提高nt-3濃度后,采用背根神經(jīng)節(jié)法驗證緩釋nt-3的生物學活性,第一天nt-3緩釋液可以促進(72.00±8.19)根神經(jīng)突生長,第四天為(32.67±8.14)根,第七天為(10.33±2.52)根,第十四天為(31.67±8.96)根,二十一天為(8.33±3.79)根,二十八天為(5.00±1.00)根,三十五天為(4.67±1.53)根,陰性對照為(9.00±2.00)根,陽性對照為(93.67±33.23)根。其中低于陰性對照組的是二十八天、三十五天、二十一天結(jié)果;在培養(yǎng)基中,被分解的nt-3交聯(lián)脫細胞脊髓支架整體蛋白,經(jīng)bca蛋白濃度測定試劑盒測定,在1、4、7、14、21、28天的不同時間段內(nèi)緩釋的蛋白濃度均低于0.2ug,證明被加入培養(yǎng)基條件下,nt-3交聯(lián)脫細胞脊髓支架可以保留28天。3.3.7×105/ml,40ul大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞懸液被后復(fù)合nt-3交聯(lián)脫細胞脊髓支架后,4小時細胞粘附數(shù)量為(109±5)個,優(yōu)于交聯(lián)支架(46±19)個;濃度為1.0×105/ml,10ul大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞懸浮液,與不同組支架共培養(yǎng)24小時和48小時后,nt-3交聯(lián)脫細胞脊髓支架均有利于大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞增殖。結(jié)論:1.脫細胞法被成功優(yōu)化,細胞成分被較徹底地去除,脊髓ECM三維空間結(jié)構(gòu)被較完整地保留,各項指標如“優(yōu)”等率、孔隙率、含水率、酶解率優(yōu)于傳統(tǒng)制備支架。2.NT-3交聯(lián)脫細胞脊髓支架在ELISA法檢測下,NT-3緩釋性可達35天;緩釋NT-3,具有生物學活性;經(jīng)BCA蛋白測定法,NT-3交聯(lián)脫細胞脊髓支架,在培養(yǎng)箱中,加入培養(yǎng)基,可以保留28天。3.BMSCs被NT-3交聯(lián)脫細胞脊髓支架復(fù)合,相比于脫細胞脊髓支架,具有促進BMSCs粘附、增殖的作用。
【關(guān)鍵詞】：脊髓損傷 脫細胞方法優(yōu)化 NT-3交聯(lián)脫細胞脊髓支架 緩釋系統(tǒng) 生物活性 骨髓間充質(zhì)干細胞 粘附性 增值性
【學位授予單位】：第三軍醫(yī)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R318.08;R651.2
【目錄】：

• 縮略語表4-5
• 英文摘要5-9
• 中文摘要9-12
• 第一章 前言12-14
• 第二章 大鼠脫細胞脊髓支架制備方法的優(yōu)化14-26
• 2.1 材料與方法14-18
• 2.2 結(jié)果18-23
• 2.3 討論23-25
• 2.4 小結(jié)25-26
• 第三章 制備NT-3 交聯(lián)脫細胞脊髓支架及其緩釋性研究26-37
• 3.1 材料與方法26-30
• 3.2 結(jié)果30-34
• 3.3 討論34-36
• 3.4 小結(jié)36-37
• 第四章 NT-3 交聯(lián)脫細胞脊髓支架對大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞粘附和增殖影響的研究37-43
• 4.1 材料與方法37-39
• 4.2 結(jié)果39-42
• 4.3 討論42
• 4.4 小結(jié)42-43
• 全文結(jié)論43-44
• 參考文獻44-48
• 文獻綜述 組織支架修復(fù)脊髓損傷的研究進展48-54
• 參考文獻52-54
• 攻讀研究生期間發(fā)表的論文54-55
• 致謝55

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本文編號：759849