本文關(guān)鍵詞：不同載荷機械牽伸通過mTORC1信號通路調(diào)節(jié)肌腱異位骨化

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【摘要】：肌腱病是常見的運動損傷性疾病之一,常見的肌腱病有：跟腱炎、岡上肌腱炎、網(wǎng)球肘、跳躍膝等,占運動員職業(yè)病的48%以上。在普通勞動人群中,發(fā)病率可達40%以上。由于目前肌腱病的病因不明,加上治療手段有限,大約30%的肌腱病患者保守治療無效,轉(zhuǎn)為難治性肌腱病。肌腱病嚴重影響熱愛運動人群的生活質(zhì)量和運動員的運動生涯。人在正常生理情況下,運動過程中肌腱受到牽拉所導(dǎo)致的微損傷與肌腱自身的修復(fù)過程保持著一定的動態(tài)平衡。當(dāng)這種動態(tài)平衡被打破,將隨之產(chǎn)生病理改變,使肌腱微損傷加劇,如不及時干預(yù)將最終發(fā)展成為肌腱病。臨床研究發(fā)現(xiàn),肌腱病患者的肌腱組織中普遍存在著異位骨化,而異位骨化正是肌腱病的重要病理表現(xiàn)之一。異位骨化產(chǎn)生原因可能是肌腱過度使用引起的肌腱微小損傷累積所致,但肌腱中骨化的組織來源還不十分清楚。肌腱細胞是肌腱組織中的主要功能細胞,它具有合成和分泌細胞外基質(zhì)的功能,參與肌腱微損傷的修復(fù)。但肌腱細胞作為終未細胞,不具備自我更新能力,自身修復(fù)功能弱,沒有分化潛能。肌腱中的骨化組織需要一種骨的前體細胞來分化形成骨組織,但是骨組織的來源仍不清楚。有研究發(fā)現(xiàn)肌腱組織中存在著另外一種細胞,并命名為肌腱干細胞,它具有多向分化潛能,是肌腱細胞的前體細胞,也是肌腱細胞唯一來源,其自身分化能力強,直接參與肌腱微損傷的再生與修復(fù)。因此,肌腱干細胞可能對肌腱微損傷修復(fù)起到?jīng)Q定性作用。研究肌腱干細胞成骨分化調(diào)控對肌腱微損傷修復(fù)的作用及機制具有重要的科學(xué)意義和臨床價值。物理治療特別是偏心訓(xùn)練對肌腱病有著良好的治療效果。機械應(yīng)力加載是偏心訓(xùn)練發(fā)揮治療作用的主要因素。然而,過度的機械應(yīng)力加載卻是導(dǎo)致肌腱異位骨化的重要因素。機械應(yīng)力加載對肌腱病具有治療和致病雙重作用,其潛在機制目前尚不清楚。前人報道,在一定的牽伸條件下,肌腱干細胞向肌腱細胞分化的趨勢起主要作用；而在有些牽伸條件下,肌腱干細胞表現(xiàn)出向成骨細胞方向分化的趨勢為主；這些研究結(jié)果提示肌腱微損傷與修復(fù)過程中,一定的牽伸條件可能導(dǎo)致肌腱干細胞向成肌腱分化有利于肌腱微小損傷的修復(fù),也可導(dǎo)致肌腱干細胞向成骨細胞方向分化,加重肌腱微損傷,導(dǎo)致肌腱自身修復(fù)失敗。機械應(yīng)力加載如何控制肌腱干細胞分化是肌腱病發(fā)病機制研究的重要問題之一。mTOR(mammalian target of rapamycin)被稱為哺乳動物雷帕霉素靶蛋白,是一種進化上十分保守的絲蘇氨酸蛋白激酶,其中的TOR分子通過磷酸化其下游分子發(fā)揮生物學(xué)作用。mTOR有兩類復(fù)合物：mTORC1和mTORC2.兩種復(fù)合物功能各異,關(guān)于mTORC1的研究相對較多。mTORC1在調(diào)控細胞的生長和能量代謝中起著十分重要的作用,其參與了核苷酸合成、蛋白質(zhì)翻譯、脂肪生成、糖酵解與自吞噬等重要的生理過程。其催化底物為核糖體蛋白s6激酶(p70s6k)和真核細胞翻譯起始因子4E結(jié)合蛋白1(4E-BP1)。p70s6k的Thr389位點被磷酸化而激活,正向調(diào)控蛋白的翻譯,促進核蛋白活性增加從而提高蛋白的翻譯；相反,4E-BP1則負向調(diào)控蛋白起始因子,其磷酸化后與真核翻譯起始因子4E (elF4E)分離,使eIF4E與eIF4G結(jié)合/形成elF4F復(fù)合物,提高蛋白的翻譯起始率。mTORCl作為本課題主要的研究對象,可以被其特異性抑制劑雷帕霉素(rapamycin)所抑制。另一種mTOR復(fù)合物,mTORC2主要參與肌動蛋白細胞骨架調(diào)控、葡萄糖代謝、脂肪形成、細胞凋亡等生命活動。mTORC2不能被雷帕霉素所抑制。多項研究表明,機械應(yīng)力可以增加mTORC1下游蛋白p70S6k的磷酸化,說明機械應(yīng)力可以激活mTORC1信號通路。使用mTORC1特異抑制劑雷帕霉素或mTORC1基因敲除可以對成骨分化起到刺激或抑制作用。因此,機械應(yīng)力可能通過mTORC1信號通路調(diào)節(jié)肌腱干細胞的成骨分化,但其機制尚不清楚�；谇叭说膱蟮�,我們提出以下假說：機械應(yīng)力載荷可引起肌腱干細胞中mTORC1信號通路的改變,從而影響肌腱干細胞的成骨分化。我們課題設(shè)計為：體外分離培養(yǎng)大鼠跟腱來源的肌腱干細胞,并在Flexcell FX-5000應(yīng)力加載系統(tǒng)中進行不同幅度的牽伸,分別應(yīng)用Real-time PCR和Western blot檢測牽伸后肌腱干細胞的成骨分化相關(guān)因子Runx2和OSX的表達情況。加入mTORC1特異性抑制劑雷帕霉素抑制肌腱干細胞中的mTORC1信號通路,在機械牽伸后,分別應(yīng)用Real-time PCR檢測Runx2和OSX的表達情況,明確牽伸情況下mTORC1信號通路在肌腱干細胞異常成骨分化中的作用。除了對細胞進行不同幅度機械牽伸,我們還建立了可模擬不同牽伸負荷的動物模型。在前人研究異位骨化的動物模型基礎(chǔ)上,我們應(yīng)用石膏固定模擬不同幅度的牽伸。通過免疫組化染色和Micro CT掃描檢測應(yīng)力對于異位骨化的影響。給實驗動物腹腔注射雷帕霉素抑制體內(nèi)mTORC1信號通路,研究mTORC1信號通路在肌腱異位骨化中的作用。根據(jù)以上假設(shè),我們將課題研究分三部分。1.不同載荷機械牽伸對跟腱干細胞成骨分化及跟腱異位骨化的影響1.1分別從基因表達水平和蛋白表達水平兩個方面著手,研究肌腱干細胞在不同牽伸條件下,成骨分化指標(biāo)Runx2和OSX的表達水平及變化趨勢。1.2實驗分組：無牽伸對照組(NS),4%牽伸強度組(4%),12%牽伸強度組(12%)。1.2.1不同牽伸強度對Runx2和OSX基因表達水平影響應(yīng)用Real-time PCR檢測不同牽伸條件下跟腱細胞RUNX2和OSX基因的表達量,結(jié)果顯示,4%機械應(yīng)力刺激下跟腱細胞RUNX2和OSX基因表達較未經(jīng)機械應(yīng)力刺激的細胞顯著下降(P0.05)；12%機械應(yīng)力刺激下跟腱細胞RUNX2和OSX基因表達較未經(jīng)機械應(yīng)力刺激的細胞顯著升高(P0.05)。1.2.2不同牽伸強度對Runx2和OSX蛋白表達水平影響應(yīng)用Western blot檢測不同牽伸條件下跟腱細胞RUNX2和OSX蛋白的表達量,結(jié)果顯示,4%機械應(yīng)力刺激下跟腱細胞RUNX2和OSX蛋白表達較未經(jīng)機械應(yīng)力刺激的細胞顯著下降(P0.05)；12%機械應(yīng)力刺激下跟腱細胞RUNX2和OSX蛋白表達較未經(jīng)機械應(yīng)力刺激的細胞顯著升高(P0.05)。1.2.3應(yīng)用HE染色及Micro CT掃描檢測不同牽伸強度對跟腱異位骨化的影響1.2.1實驗分組：無牽伸對照組(Ctrl),低幅度牽伸組(LE),高幅度牽伸組(HE)。1.2.2不同牽伸強度對跟腱異位骨化的影響1.2.3Ctrl組、LE組和HE組大鼠右側(cè)跟腱HE染色顯示,三組跟腱均有異位骨化發(fā)生,出現(xiàn)骨髓腔,成骨樣細胞。LE組較Ctrl組異位骨化程度輕,而HE組較Ctrl組及LE組異位骨化程度要中重。Ctrl組、LE組和HE組大鼠右下肢Micro CT掃描顯示,LE組異位骨化BV/T、Tb.N、Tb.T數(shù)值均較Ctrl組顯著下降(P0.05)；HE組組異位骨化BV/TV、Tb.N、Tb.T數(shù)值均較Ctrl組顯著升高(P0.05)。2.不同幅度機械應(yīng)力對跟腱細胞及大鼠跟腱mTORC1信號通路的影響2.1從蛋白表達水平著手,研究肌腱干細胞在不同牽伸條件下,磷酸化p70s6k的表達水平及變化趨勢。2.1.1實驗分組：無牽伸對照組(NS),4%牽伸強度組(4%),12%牽伸強度組(12%)。2.2.2機械牽伸對肌腱干細胞中磷酸化p70s6k蛋白表達水平的影響應(yīng)用Western blot檢測不同牽伸條件下跟腱細胞p-P70S6K蛋白的表達量,結(jié)果顯示,4%機械應(yīng)力刺激下跟腱細胞p-P70S6K蛋白表達較未經(jīng)機械應(yīng)力刺激的細胞顯著下降(P0.05)；12%機械應(yīng)力刺激下跟腱細胞p-P70S6K蛋白表達較未經(jīng)機械應(yīng)力刺激的細胞顯著升高(P0.05)。2.2.3應(yīng)用免疫組化染色檢測不同牽伸強度對跟腱磷酸化p70s6k表達水平的影響2.2.1實驗分組：無牽伸對照組(Ctrl),低幅度牽伸組(LE),高幅度牽伸組(HE)。2.2.2不同牽伸強度對跟腱mTORC1信號通路的影響各組大鼠右側(cè)跟腱免疫組化染色顯示,LE組跟腱細胞磷酸化p70s6k蛋白表達量較Ctrl組顯著下降(P0.05)；HE組跟腱細胞磷酸化p70s6k蛋白表達量較Ctrl組及LE組顯著升高(P0.05)。3.抑制mTORC1信號通路對機械應(yīng)力誘導(dǎo)的跟腱細胞成骨分化和跟腱異位骨化的影響。3.1蛋白表達水平方面著手,研究肌腱干細胞在不同牽伸條件下以及雷帕霉素干預(yù)下,成骨分化指標(biāo)Runx2和OSX的表達水平及變化趨勢。3.2實驗分組：無牽伸對照組(NS),4%牽伸強度組(4%),4%牽伸強度加雷帕霉素組(4%+Rapa),12%牽伸強度組(12%),12%牽伸強度加雷帕霉素組(12%+Rapa)。3.2.2不同牽伸強度及雷帕霉素干預(yù)對Runx2和OSX蛋白表達水平影響應(yīng)用Western blot檢測雷帕霉素對不同牽伸條件下跟腱細胞RUNX2和OSX蛋白表達的影響。未經(jīng)機械應(yīng)力牽伸的NS組及NS+Rapa組,NS+Rapa組RUNX2和OSX蛋白表達量較NS組顯著下降(P0.05)。4%機械應(yīng)力刺激下的4%組和4%+Rapa組,4%+Rapa組RUNX2和OSX蛋白表達量較4%組顯著下降(P0.05)。12%機械應(yīng)力刺激下的12%組和12%+Rapa組,12%+Rapa組RUNX2蛋白表達量較4%組顯著升高(P0.05)。3.2.3應(yīng)用免疫組化染色檢測不同牽伸強度及雷帕霉素干預(yù)對跟腱異位骨化的影響3.2.1實驗分組：無牽伸對照組(Ctrl),無牽伸對照加雷帕霉素組(Ctrl+Rapa),低幅度牽伸組(LE),低幅度牽伸加雷帕霉素組(LE+Rapa),高幅度牽伸組(HE),高幅度牽伸加雷帕霉素組(HE+Rapa)3.2.2不同牽伸強度及雷帕霉素干預(yù)對跟腱異位骨化的影響各組大鼠右側(cè)跟腱免疫組化染色顯示,Ctrl+Rapa組跟腱細胞RUNX2和OSX蛋白表達量較Ctrl組顯著下降(P0.05)；LE+Rapa組跟腱細胞RUNX2和OSX蛋白表達量較LE組顯著下降(P0.05)；]HE+Rapa組跟腱細胞RUNX2和OSX蛋白表達量較HE組顯著下降(P0.05)。總結(jié)本研究采用Flexcell FX-5000應(yīng)力加載系統(tǒng),選用4%、12%牽伸應(yīng)變量,每天牽伸8小時,模擬反復(fù)機械牽伸所導(dǎo)致肌腱病的慢性損傷過程,觀察肌腱干細胞在不同牽伸狀態(tài)下成骨分化的情況。此外,加入mTORC1特異抑制劑雷帕霉素,觀察mTORC1被抑制后機械應(yīng)力對跟腱干細胞成骨分化的影響。我們發(fā)現(xiàn),雷帕霉素加強了4%機械牽伸抑制跟腱干細胞成骨分化的作用；同時,雷帕霉素也減弱了12%機械應(yīng)力促進跟腱干細胞成骨分化的作用。在動物實驗中,構(gòu)建了承受不同機械應(yīng)力的大鼠模型,用腹腔注射雷帕霉素的方法抑制mTORC1信號通路。結(jié)果發(fā)現(xiàn),雷帕霉素加強了低幅度機械牽伸抑制跟腱異位化的作用；同時,雷帕霉素也減弱了高幅度機械應(yīng)力促進跟腱異位骨化的作用。細胞實驗結(jié)果與動物實驗結(jié)果相一致,說明機械應(yīng)力通過mTORC1信號通路調(diào)節(jié)跟腱干細胞的成骨分化以及肌腱的異位骨化。低幅度的機械牽伸可以抑制跟腱干細胞的成骨分化和肌腱的異位骨化,這發(fā)現(xiàn)可能可以指導(dǎo)我們在臨床中對于肌腱病的治療。此外,雷帕霉素通過直接抑制mTORC1也可發(fā)揮抑制跟腱干細胞的成骨分化和肌腱異位骨化的作用,因此,雷帕霉素可能可以作為一種新的肌腱病的治療藥物。
【關(guān)鍵詞】：機械牽伸 肌腱干細胞 成骨分化 異位骨化 mTORC1
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R686.1
【目錄】：

• 摘要3-9
• ABSTRACT9-14
• 前言14-18
• 第一章 不同載荷機械牽伸對跟腱干細胞成骨分化及跟腱異位骨化的影響18-36
• 1.1 引言18-19
• 1.2 材料和方法19-29
• 1.3 結(jié)果29-33
• 1.4 討論33-36
• 第二章 不同幅度機械應(yīng)力對跟腱細胞及大鼠跟腱mTORC1信號通路的影響36-44
• 2.1 引言36-37
• 2.2 材料和方法37-40
• 2.3 結(jié)果40-42
• 2.4 討論42-44
• 第三章 抑制mTORC1信號通路對機械應(yīng)力誘導(dǎo)的跟腱細胞成骨分化和跟腱異位骨化的影響44-54
• 3.1 引言44-45
• 3.2 材料和方法45-50
• 3.3 結(jié)果50-52
• 3.4 討論52-54
• 全文總結(jié)54-55
• 參考文獻55-58
• 中英文縮略詞對照表58-59
• 攻讀學(xué)位期間成果59-60
• 致謝60-62

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