本文關鍵詞：沉默TRPV1基因對利多卡因所致細胞凋亡的影響及其機制

  更多相關文章： 利多卡因 瞬態(tài)電壓感受器陽離子通道 鈣超載 凋亡

【摘要】：目的:構建針對人TRPV1基因的p SUPERretro-puro TRPV1逆轉錄病毒表達載體,感染U87-MG細胞,觀測其沉默TRPV1基因的效果。通過沉默TRPV1基因觀測利多卡因處理后對U87-MG的細胞狀態(tài)和凋亡情況的影響,以探討利多卡因是否通過TRPV1產生神經(jīng)毒性損傷。方法:利用Ambion在線設計軟件設計針對人TRPV1基因的sh RNA干擾序列,克隆到p SUPERretro-puro載體上。對重組質粒進行DNA序列測定和酶切分析。用磷酸鈣法制備p SUPERretro-puro TRPV1逆轉錄病毒,將其感染到U87-MG細胞,經(jīng)嘌呤酶素篩選陽性克隆后采用熒光定量PCR及Western blotting法檢測TRPV1表達。U87-MG的細胞分為空白對照組、基因沉默組以及空載體組。對于每個組的細胞,我們利用流式細胞技術,研究利多卡因處理后不同時間點的細胞內鈣離子濃度及線粒體膜電位情況。并通過MTT方法和流式細胞術,檢測U87-MG細胞的活力和凋亡情況。結果:經(jīng)DNA測序和酶切鑒定表明,p SUPERretro-puro TRPV1表達載體構建成功。p SUPERretro-puro TRPV1逆轉錄病毒感染U87-MG細胞后,細胞中TRPV1表達量明顯降低。U87-MG細胞活力隨著利多卡因處理濃度增高而降低。利多卡因處理各組細胞后隨著時間增加,細胞內鈣離子濃度逐漸上升。TRVP1基因沉默組的各時點鈣離子濃度顯著比其他各組低(P0.05)。利多卡因處理后,對照組U87-MG細胞的線粒體膜電位明顯下降,而在TRVP1基因沉默組線粒體膜電位較高(P0.05)。同時,流式細胞結果顯示,利多卡因處理后,各組的細胞凋亡增高,而在TRVP1基因沉默組則明顯低于對照組(P0.05)。結論:成功構建了針對人TRPV1基因的p SUPERretro-puro TRPV1表達載體。p SUPERretro-puro TRPV1能有效下調TRPV1基因在U87-MG細胞中的表達。利多卡因可導致U87-MG細胞內鈣離子濃度增高,線粒體膜電位降低和細胞凋亡增多。同時,沉默TRPV1基因可降低利多卡因的這些損傷作用。這提示TRPV1與利多卡因神經(jīng)毒性損傷機制有關。利多卡因可能通過激活TRPV1通道蛋白來增加細胞內鈣離子濃度,降低線粒體膜電位并介導細胞凋亡。
【關鍵詞】：利多卡因 瞬態(tài)電壓感受器陽離子通道 鈣超載 凋亡
【學位授予單位】：南昌大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R614
【目錄】：

• 摘要3-5
• ABSTRACT5-9
• 中英文縮略詞表9-10
• 第1章 前言10-12
• 第2章 實驗材料與方法12-23
• 2.1 實驗材料12-14
• 2.1.1 逆轉錄病毒及細胞來源12
• 2.1.2 主要試劑12-13
• 2.1.3 主要實驗儀器和設備13-14
• 2.2 實驗方法與步驟14-22
• 2.2.1 制備主要試劑14-15
• 2.2.2 細胞培養(yǎng)15
• 2.2.3 shRNA干擾序列設計15-16
• 2.2.4 構建pSUPERretro-puro TRPV1表達載體16-18
• 2.2.5 細胞感染與篩選18-19
• 2.2.6 熒光定量PCR檢測TRPV1表達19
• 2.2.7 Western blotting檢測TRPV1表達19-20
• 2.2.8 細胞實驗20-22
• 2.3 統(tǒng)計學分析22-23
• 第3章 結果23-30
• 3.1 重組載體及相應細胞株構建的結果23-25
• 3.1.1 重組質粒測序的結果23-24
• 3.1.2 熒光定量PCR檢測轉染細胞TRPV1 m RNA的表達24
• 3.1.3 Western blotting檢測轉染細胞TRPV1蛋白的表達24-25
• 3.2 TRPV1低表達對利多卡因所致細胞凋亡的影響25-30
• 3.2.1 利多卡因處理后細胞抑制率的結果25-26
• 3.2.2 利多卡因誘發(fā)細胞內鈣離子濃度變化26
• 3.2.3 細胞線粒體膜電位變化26-27
• 3.2.4 細胞凋亡結果27-30
• 第4章 討論30-33
• 第5章 結論與展望33-34
• 5.1 結論33
• 5.2 展望33-34
• 致謝34-35
• 參考文獻35-38
• 攻讀學位期間的研究成果38-39
• 綜述 局部麻醉藥神經(jīng)細胞毒性作用機制研究進展39-43
• 參考文獻41-43

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本文編號：722522