本文關(guān)鍵詞：沉默TRPV1基因?qū)嗫ㄒ蛩录?xì)胞凋亡的影響及其機(jī)制

  更多相關(guān)文章： 利多卡因 瞬態(tài)電壓感受器陽離子通道 鈣超載 凋亡

【摘要】：目的:構(gòu)建針對人TRPV1基因的p SUPERretro-puro TRPV1逆轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)載體,感染U87-MG細(xì)胞,觀測其沉默TRPV1基因的效果。通過沉默TRPV1基因觀測利多卡因處理后對U87-MG的細(xì)胞狀態(tài)和凋亡情況的影響,以探討利多卡因是否通過TRPV1產(chǎn)生神經(jīng)毒性損傷。方法:利用Ambion在線設(shè)計軟件設(shè)計針對人TRPV1基因的sh RNA干擾序列,克隆到p SUPERretro-puro載體上。對重組質(zhì)粒進(jìn)行DNA序列測定和酶切分析。用磷酸鈣法制備p SUPERretro-puro TRPV1逆轉(zhuǎn)錄病毒,將其感染到U87-MG細(xì)胞,經(jīng)嘌呤酶素篩選陽性克隆后采用熒光定量PCR及Western blotting法檢測TRPV1表達(dá)。U87-MG的細(xì)胞分為空白對照組、基因沉默組以及空載體組。對于每個組的細(xì)胞,我們利用流式細(xì)胞技術(shù),研究利多卡因處理后不同時間點的細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度及線粒體膜電位情況。并通過MTT方法和流式細(xì)胞術(shù),檢測U87-MG細(xì)胞的活力和凋亡情況。結(jié)果:經(jīng)DNA測序和酶切鑒定表明,p SUPERretro-puro TRPV1表達(dá)載體構(gòu)建成功。p SUPERretro-puro TRPV1逆轉(zhuǎn)錄病毒感染U87-MG細(xì)胞后,細(xì)胞中TRPV1表達(dá)量明顯降低。U87-MG細(xì)胞活力隨著利多卡因處理濃度增高而降低。利多卡因處理各組細(xì)胞后隨著時間增加,細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度逐漸上升。TRVP1基因沉默組的各時點鈣離子濃度顯著比其他各組低(P0.05)。利多卡因處理后,對照組U87-MG細(xì)胞的線粒體膜電位明顯下降,而在TRVP1基因沉默組線粒體膜電位較高(P0.05)。同時,流式細(xì)胞結(jié)果顯示,利多卡因處理后,各組的細(xì)胞凋亡增高,而在TRVP1基因沉默組則明顯低于對照組(P0.05)。結(jié)論:成功構(gòu)建了針對人TRPV1基因的p SUPERretro-puro TRPV1表達(dá)載體。p SUPERretro-puro TRPV1能有效下調(diào)TRPV1基因在U87-MG細(xì)胞中的表達(dá)。利多卡因可導(dǎo)致U87-MG細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度增高,線粒體膜電位降低和細(xì)胞凋亡增多。同時,沉默TRPV1基因可降低利多卡因的這些損傷作用。這提示TRPV1與利多卡因神經(jīng)毒性損傷機(jī)制有關(guān)。利多卡因可能通過激活TRPV1通道蛋白來增加細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度,降低線粒體膜電位并介導(dǎo)細(xì)胞凋亡。
【關(guān)鍵詞】：利多卡因 瞬態(tài)電壓感受器陽離子通道 鈣超載 凋亡
【學(xué)位授予單位】：南昌大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R614
【目錄】：

• 摘要3-5
• ABSTRACT5-9
• 中英文縮略詞表9-10
• 第1章 前言10-12
• 第2章 實驗材料與方法12-23
• 2.1 實驗材料12-14
• 2.1.1 逆轉(zhuǎn)錄病毒及細(xì)胞來源12
• 2.1.2 主要試劑12-13
• 2.1.3 主要實驗儀器和設(shè)備13-14
• 2.2 實驗方法與步驟14-22
• 2.2.1 制備主要試劑14-15
• 2.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)15
• 2.2.3 shRNA干擾序列設(shè)計15-16
• 2.2.4 構(gòu)建pSUPERretro-puro TRPV1表達(dá)載體16-18
• 2.2.5 細(xì)胞感染與篩選18-19
• 2.2.6 熒光定量PCR檢測TRPV1表達(dá)19
• 2.2.7 Western blotting檢測TRPV1表達(dá)19-20
• 2.2.8 細(xì)胞實驗20-22
• 2.3 統(tǒng)計學(xué)分析22-23
• 第3章 結(jié)果23-30
• 3.1 重組載體及相應(yīng)細(xì)胞株構(gòu)建的結(jié)果23-25
• 3.1.1 重組質(zhì)粒測序的結(jié)果23-24
• 3.1.2 熒光定量PCR檢測轉(zhuǎn)染細(xì)胞TRPV1 m RNA的表達(dá)24
• 3.1.3 Western blotting檢測轉(zhuǎn)染細(xì)胞TRPV1蛋白的表達(dá)24-25
• 3.2 TRPV1低表達(dá)對利多卡因所致細(xì)胞凋亡的影響25-30
• 3.2.1 利多卡因處理后細(xì)胞抑制率的結(jié)果25-26
• 3.2.2 利多卡因誘發(fā)細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度變化26
• 3.2.3 細(xì)胞線粒體膜電位變化26-27
• 3.2.4 細(xì)胞凋亡結(jié)果27-30
• 第4章 討論30-33
• 第5章 結(jié)論與展望33-34
• 5.1 結(jié)論33
• 5.2 展望33-34
• 致謝34-35
• 參考文獻(xiàn)35-38
• 攻讀學(xué)位期間的研究成果38-39
• 綜述 局部麻醉藥神經(jīng)細(xì)胞毒性作用機(jī)制研究進(jìn)展39-43
• 參考文獻(xiàn)41-43

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4 袁利,侯玉華;利多卡因治療椎基底動脈供血不足的療效觀察[J];河南實用神經(jīng)疾病雜志;2004年01期

5 馬傳新,岳旺;利多卡因?qū)﹄婞c燃模型的作用研究評價[J];藥學(xué)實踐雜志;2004年05期

6 王效德,楊建剛,常方成,靳素珊,張霞;利多卡因的臨床新用途[J];齊魯護(hù)理雜志;2004年12期

7 宮云娟;利多卡因的臨床新用途[J];中國社區(qū)醫(yī)師;2005年09期

8 楊弋弋;孫勃;;利多卡因在絕經(jīng)后婦女取環(huán)術(shù)中的應(yīng)用[J];中國社區(qū)醫(yī)師(綜合版);2005年19期

9 宋萍萍;王東信;王沛鈺;;利多卡因?qū)Σ煌d脂蛋白E基因型小鼠短暫全腦缺血后腦損害程度的影響[J];中華醫(yī)學(xué)雜志;2005年48期

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2 許樝;歐冊華;黎昌強(qiáng);陳德宇;;靜脈利多卡因治療帶狀皰疹后遺神經(jīng)痛[A];2009全國中西醫(yī)結(jié)合皮膚性病學(xué)術(shù)會議論文匯編[C];2009年

3 伍錕;季龍振;;利多卡因中藥聯(lián)合灌腸治療慢性腎功能衰竭[A];第六屆全國中西醫(yī)結(jié)合腎臟病學(xué)術(shù)會議論文匯編[C];2000年

4 偠麟;;利多卡因在治療耳鳴療效中的觀察[A];第二十一屆航天醫(yī)學(xué)年會暨第四屆航天護(hù)理年會論文匯編（下冊）[C];2005年

5 張保華;宋敏;;利多卡因穴封治療腦卒中頑固性呃逆臨床觀察[A];中國特種針法應(yīng)用與針灸臨床學(xué)術(shù)交流大會論文集[C];2000年

6 李德聯(lián);;大劑量利多卡因致呼吸停止1例[A];中華醫(yī)學(xué)會急診醫(yī)學(xué)分會復(fù)蘇、災(zāi)害、中毒專業(yè)聯(lián)合學(xué)術(shù)交流會資料匯編[C];1999年

7 李新友;屠偉峰;;利多卡因?qū)θ毖俟嘧⑦^程中中性粒細(xì)胞的影響[A];2006年中華醫(yī)學(xué)會全國麻醉學(xué)術(shù)年會知識更新講座[C];2006年

8 周歡歡;凌曉飛;王秋惠;;利多卡因凝膠輔助留置導(dǎo)尿減少術(shù)后躁動的觀察[A];中華護(hù)理學(xué)會第15屆全國手術(shù)室護(hù)理學(xué)術(shù)交流會議論文匯編[C];2011年

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10 尉志文;，

本文編號：722522