發(fā)布時(shí)間：2017-08-11 20:10

  本文關(guān)鍵詞：KGN聯(lián)合純富血小板血漿促進(jìn)腱骨愈合和纖維軟骨再生的實(shí)驗(yàn)研究

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【摘要】：第一部分驗(yàn)證KGN促進(jìn)肌腱干細(xì)胞成軟骨分化的能力目的:體外實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證KGN促進(jìn)肌腱干細(xì)胞向軟骨分化的能力,檢驗(yàn)體內(nèi)應(yīng)用KGN促進(jìn)腱骨愈合研究的可行性,為隨后實(shí)驗(yàn)提供理論基礎(chǔ)。方法:采用膠原酶和中性酶消化法獲取原代肌腱干細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng),采用單細(xì)胞培養(yǎng)法提純肌腱干細(xì)胞。然后通過(guò)免疫熒光和流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞表面標(biāo)志物以鑒定所提取細(xì)胞是否是肌腱干細(xì)胞。然采用不同濃度的KGN處理肌腱干細(xì)胞;使用CCK-8方法檢測(cè)KGN對(duì)于肌腱干細(xì)胞的促增殖效應(yīng);使用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)方法檢測(cè)KGN對(duì)于肌腱干細(xì)胞的促分化效應(yīng)。結(jié)果:采用膠原酶和中性酶消化法以及單細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù),并經(jīng)過(guò)免疫熒光和流式細(xì)胞術(shù)鑒定結(jié)果表明以上方法可以獲取純度較高的原代肌腱干細(xì)胞。通過(guò)CCK-8方法檢測(cè)的增殖實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明不同KGN濃度(1n M,10n M,100n M,1μM,10μM)的實(shí)驗(yàn)組中細(xì)胞增殖速度并未見(jiàn)明顯差異,并且與空白對(duì)照組無(wú)明顯差異,這表明KGN對(duì)肌腱干細(xì)胞的促增殖能力不明顯。通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)方法檢測(cè)不同濃度KGN處理后肌腱干細(xì)胞中軟骨分化相關(guān)的三個(gè)標(biāo)志物(Col-2,Sox-9和Aggrecan)均有不同程度的升高,而且升高程度與KGN濃度正相關(guān),這也表明KGN促進(jìn)肌腱干細(xì)胞成軟骨分化能力突出。結(jié)論:我們采用的肌腱干細(xì)胞提取和鑒定方法較為成熟,可以獲取純度較高的肌腱干細(xì)胞。KGN無(wú)明顯促進(jìn)肌腱干細(xì)胞增殖的能力,但KGN誘導(dǎo)肌腱干細(xì)胞成軟骨分化作用明顯。通過(guò)對(duì)于KGN的體外實(shí)驗(yàn)研究和驗(yàn)證結(jié)果表明KGN對(duì)于肌腱干細(xì)胞的作用符合我們預(yù)期,適合應(yīng)用于腱骨愈合的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究,因而可將KGN用于下一步的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)。第二部分L-PRP與P-PRP對(duì)肌腱干細(xì)胞的不同細(xì)胞學(xué)作用目的:以肌腱干細(xì)胞作為細(xì)胞研究對(duì)象,研究?jī)煞N不同的富血小板血漿血漿(P-PRP(純富血小板血漿)和L-PRP(富含白細(xì)胞血小板血漿))對(duì)肌腱干細(xì)胞的合成,分解代謝水平以及炎癥反應(yīng)的同作用,最終獲得L-PRP與P-PRP的不同細(xì)胞學(xué)作用,并選出其中更有利于組織修復(fù)的一種PRP用于隨后的動(dòng)物實(shí)驗(yàn);聯(lián)合KGN并作為其載體應(yīng)用于腱骨愈合的實(shí)驗(yàn)研究中。方法:使用高速短時(shí)間的二次離心法獲取P-PRP和L-PRP,將獲得的兩種PRP調(diào)整至相同的血小板濃度。采用與第一部分相同的方法制取和鑒定肌腱干細(xì)胞。使用Transwell系統(tǒng)對(duì)肌腱干細(xì)胞進(jìn)行體外培養(yǎng),細(xì)胞置于下層,P-PRP或L-PRP放入上層。使用CCK-8進(jìn)行細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)檢測(cè)L-PRP和P-PRP在2%,5%,10%和20%四種不同濃度下對(duì)肌腱干細(xì)胞的增殖作用。另一部分細(xì)胞連續(xù)培養(yǎng)14天,通過(guò)光鏡不斷監(jiān)測(cè)細(xì)胞形態(tài),并收集細(xì)胞培養(yǎng)液上清和細(xì)胞通過(guò)RT-PCR、Western Blot、細(xì)胞免疫熒光染色以及ELISA等手段檢測(cè)不同處理后細(xì)胞的合成代謝、分解代謝以及炎癥狀態(tài)。結(jié)果:我們采用的PRP制取方法可以穩(wěn)定的獲取3倍濃度的P-PRP和L-PRP。細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明P-PRP和L-PRP均可明顯促進(jìn)肌腱干細(xì)胞增殖,并且與劑量相關(guān),在10%的濃度時(shí)促增殖效果最佳,而濃度若繼續(xù)升高促增殖能力逐漸下降。兩種PRP均可誘導(dǎo)肌腱干細(xì)胞成肌腱細(xì)胞分化并能激活肌腱細(xì)胞。但是兩種PRP在很多效果上還存在差異。L-PRP可促進(jìn)肌腱干細(xì)胞處于更高的分解代謝和炎癥狀態(tài);它的作用可以提高分解代謝相關(guān)因子MMP-1和MMP-13以及炎癥因子IL-1β,IL-6,TNF-α和PGE2的表達(dá)。想法P-PRP這主要提高合成代謝相關(guān)因子的表達(dá)比如COL-1,COL-3以及α-SMA。結(jié)論:這些結(jié)果表明L-PRP與P-PRP的細(xì)胞學(xué)作用的確存在差異。因此PRP類(lèi)型的不同(特別是是否富含白細(xì)胞)很可能是影響PRP療效導(dǎo)致臨床結(jié)果不一致的關(guān)鍵因素。由于腱骨愈合的關(guān)鍵是促進(jìn)纖維軟骨組織的修復(fù)和再生,因此我們選擇促進(jìn)組織愈合再生方面能力更優(yōu)的P-PRP作為KGN的載體,應(yīng)用于隨后的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中,檢測(cè)KGN聯(lián)合P-PRP促進(jìn)腱骨愈合的效果。第三部分KGN聯(lián)合P-PRP促進(jìn)腱骨愈合和纖維軟骨再生的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究目的:探討KGN聯(lián)合P-PRP膠對(duì)纖維軟骨再生以及腱骨連接愈合的作用。方法:按照第二部分方法制取P-PRP,再與KGN粉末按照預(yù)先設(shè)計(jì)的濃度進(jìn)行混合。采用HPLC(高效液相色譜法)檢測(cè)KGN在P-PRP膠中的釋放情況。建立大鼠腱骨隧道愈合模型。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)總共51只大鼠,隨機(jī)分為三組進(jìn)行處理:組1向骨隧道中同時(shí)注射KGN+PRP混合液50μl+牛凝血酶5μl;組2向骨隧道中注射PRP混合液50μl+牛凝血酶5μl;組3向骨隧道中注射生理鹽水50μl+牛凝血酶5μl。同時(shí)組2與組3的溶液中含有與組1溶液中相同濃度的二甲亞砜。于術(shù)后第4周,8周,12周取組織標(biāo)本進(jìn)行組織學(xué)檢測(cè)(HE,Safranin O+Fastgreen,IHC,IF),每次每組3只。于第8周獲取標(biāo)本進(jìn)行生物力學(xué)檢測(cè),每組8只。結(jié)果:KGN在PRP膠中的釋放實(shí)驗(yàn)表明KGN釋放可持續(xù)4天,在最開(kāi)始的4小時(shí)釋放速度最快,4-48小時(shí)釋放速度逐漸下降直至平臺(tái)期。HE和Safranin O+Fastgreen染色結(jié)果表明KGN聯(lián)合PRP膠可以明顯促進(jìn)腱骨連接處的軟骨生成,免疫染色結(jié)果顯示再生的軟骨高表達(dá)Col-1和Col-2,說(shuō)明再生軟骨為纖維軟骨。生物力學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果也表明KGN聯(lián)合PRP膠組可以明顯提升腱骨連接處的機(jī)械性能。并且我們還發(fā)現(xiàn)單獨(dú)應(yīng)用PRP膠并不能有效的促進(jìn)腱骨界面的軟骨再生。結(jié)論:KGN聯(lián)合PRP凝膠可誘導(dǎo)腱骨連接界面的纖維軟骨再生進(jìn)而促進(jìn)腱骨隧道愈合;單獨(dú)施加PRP處理則未見(jiàn)此療效。本研究結(jié)果表明在腱骨界面應(yīng)用KGN可能會(huì)成為未來(lái)臨床應(yīng)用中一種很有前景的非細(xì)胞治療手段促進(jìn)腱骨愈合。
【關(guān)鍵詞】：KGN 肌腱干細(xì)胞 增殖 分化 L-PRP P-PRP 肌腱干細(xì)胞 炎癥 代謝 KGN P-PRP 腱骨愈合 纖維軟骨
【學(xué)位授予單位】：第二軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類(lèi)號(hào)】：R686.1
【目錄】：

• 中文摘要6-9
• Abstract9-12
• 縮略詞表12-14
• 引言14-15
• 第一部分 驗(yàn)證KGN促進(jìn)肌腱干細(xì)胞成軟骨分化能力15-23
• （一）前言15
• （二）材料與方法15-19
• （三）結(jié)果19-22
• （四）討論22-23
• 第二部分 L-PRP與P-PRP對(duì)肌腱干細(xì)胞的不同細(xì)胞學(xué)作用23-48
• （一）前言23-24
• （二）材料和方法24-37
• （三）結(jié)果37-46
• （四）討論46-48
• 第三部分 KGN聯(lián)合P-PRP促進(jìn)腱骨愈合和纖維軟骨再生的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究48-66
• （一）前言48-49
• （二）材料與方法49-55
• （三）結(jié)果55-63
• （四）討論63-66
• 結(jié)論66-67
• 綜述 PRP治療在肌腱損傷中的應(yīng)用67-71
• 參考文獻(xiàn)71-86
• 攻讀碩士學(xué)位期間發(fā)表論文和參加科研工作情況說(shuō)明86-89
• 致謝89

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本文編號(hào)：658023