本文關(guān)鍵詞：TAp73、Beclin1在人骨肉瘤中表達(dá)及其臨床意義

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【摘要】：背景和目的：骨肉瘤是最常見的原發(fā)與骨組織的惡性腫瘤,主要的患病人群是兒童、青少年,致殘致死率非常高,目前臨床主要采用的治療手段是手術(shù)聯(lián)合新輔助化療。但是根據(jù)近30年來的國內(nèi)外相關(guān)文獻(xiàn)的報道,骨肉瘤患者的總體療效沒有顯著提高,總體生存率為60%左右,而且仍存在著較高的術(shù)后腫瘤復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移,很多患者是因為術(shù)后腫瘤的轉(zhuǎn)移而死亡,大部分是肺轉(zhuǎn)移。導(dǎo)致目前這種尷尬的情況主要原因是骨肉瘤對目前傳統(tǒng)的化療藥物耐藥,術(shù)后化療效果差,患者預(yù)后不理想。因此,開辟新的治療途徑,提高療效成為骨肉瘤研究的熱點。近年的研究發(fā)現(xiàn)：自噬與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展關(guān)系十分密切：自噬參與了腫瘤細(xì)胞的凋亡、耐藥、耐受放療和腫瘤干細(xì)胞分化增殖的調(diào)節(jié)。而且,有學(xué)者發(fā)現(xiàn)自噬對于骨肉瘤的生長和耐藥存在調(diào)節(jié)作用。但是,具體自噬是如何調(diào)節(jié)骨肉瘤的生長發(fā)展?如何參與腫瘤化療的耐藥?目前關(guān)于這些調(diào)節(jié)機制仍無的權(quán)威文獻(xiàn)做出具體的報道。所以我們課題組認(rèn)為通過研究骨肉瘤細(xì)胞的自噬調(diào)節(jié)機制,闡明白噬對惡性腫瘤生長、耐藥的機制。然后通過調(diào)節(jié)細(xì)胞自噬抑制骨肉瘤的生長、促進(jìn)化療的敏感性,可能是提高骨肉瘤化療的一個途徑。自噬是指從粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的無核糖體附著區(qū)脫落的雙層膜包裹部分胞質(zhì)和細(xì)胞內(nèi)需降解的細(xì)胞器、蛋白質(zhì)等成分形成自噬體,并與溶酶體融合形成自噬溶酶體,降解其所包裹的內(nèi)容物,以實現(xiàn)細(xì)胞本身的代謝需要和某些細(xì)胞器的更新。自噬一般是在機體應(yīng)激的情況下被激活,比如：細(xì)胞饑餓、缺氧、炎癥等,被認(rèn)為是細(xì)胞一種至關(guān)重要的生存機制,維持細(xì)胞的穩(wěn)態(tài)。自噬雖然是一種細(xì)胞的保護(hù)機制,維持細(xì)胞的穩(wěn)態(tài),而過度激活自噬可以導(dǎo)致細(xì)胞自噬性死亡,稱為Ⅱ型細(xì)胞程序性死亡。自噬在機體的生理和病理過程中都能看到,自噬與腫瘤的關(guān)系密切,自噬對腫瘤的作用是雙向的,既有促進(jìn)腫瘤的生長,同時也可以抑制腫瘤的生長,其具體的調(diào)控機制尚未被完全闡明。有學(xué)者認(rèn)為：自噬具有促進(jìn)腫瘤的生長、誘導(dǎo)耐藥和抗放療作用,而且已有一些自噬調(diào)節(jié)劑應(yīng)用于腫瘤的臨床試驗研究,并取得良好的效果。但是,進(jìn)一步的研究后發(fā)現(xiàn)：雖然自噬可以促進(jìn)某些腫瘤組織的發(fā)生、生長、耐藥、抗放療,當(dāng)在另一些腫瘤組織中自噬不但沒有促進(jìn)腫瘤的作用,甚至出現(xiàn)抑制腫瘤生長、發(fā)展的作用。近年來在骨肉瘤的研究中也發(fā)現(xiàn)自噬對骨肉瘤具有調(diào)節(jié)作用,但是對于其如何發(fā)揮作用的機制尚未有具體的研究進(jìn)行報道。探索自噬對骨肉瘤的調(diào)節(jié)作用,尋找一種通過調(diào)節(jié)自噬來治療骨肉瘤的精準(zhǔn)途徑是下一步研究的目的。研究發(fā)現(xiàn)：p53參與腫瘤細(xì)胞自噬的調(diào)節(jié)。Rosenfeldt等在Nature和New England J Med上發(fā)表的論文認(rèn)為,自噬在p53野生型的腫瘤細(xì)胞中有促進(jìn)腫瘤生長的作用,而在p53突變的腫瘤細(xì)胞中,自噬調(diào)節(jié)卻是一種腫瘤的抑制機制。Rao等、Mansilla等和Chakradeo等也發(fā)現(xiàn)：p53是調(diào)節(jié)自噬的關(guān)鍵因子,在p53缺失的腫瘤細(xì)胞中,自噬可以增加蒽環(huán)類抗癌藥物的療效。P53是人類重要的抗瘤基因,但是p53基因在惡性腫瘤中普遍發(fā)生突變或者缺失。P53基因的突變或缺失是骨肉瘤的一個重要的遺傳標(biāo)記。在腫瘤細(xì)胞和動物實驗中發(fā)現(xiàn)：在p53基因缺失的腫瘤中,轉(zhuǎn)染重組野生型p53基因可以抑制腫瘤的生長和耐藥,但是目前人體內(nèi)基因治療在轉(zhuǎn)染效率、穩(wěn)定性、特異性、載體的安全性等方面仍存在很多問題,這種基因治療策略還很難運用到臨床當(dāng)中。P73是p53家族的新成員,也被大多學(xué)者認(rèn)為能夠解決上述問題的p53最理想替代者。P73基因定位于人類1號染色體1p36,而在人類多種腫瘤研究中發(fā)現(xiàn),該區(qū)域基因缺失是多數(shù)腫瘤共性。然而,1p36又是人類多個抑癌基因存在的區(qū)域。因為p73基因定位的特殊性及其與p53基因結(jié)構(gòu)和功能存在高度的同源性,所以p73基因被廣大的研究學(xué)者認(rèn)為是一個新的抑癌基因。P73蛋白普遍存在于真核細(xì)胞中,它參與調(diào)控細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞生長、分化與衰老、神經(jīng)發(fā)育等過程。在很多腫瘤中p73參與腫瘤耐藥、抗放療等,能夠調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞對化療藥物的敏感性,提高藥物的化療效果等。另外,p73是與DRAM關(guān)系密切,也可以通過激活DRAM調(diào)節(jié)自噬。甚至,在有些文獻(xiàn)的報道中,p73能夠直接調(diào)節(jié)自噬相關(guān)因子,包括Atg5及Atg7。TAp73是p73全長亞型,具有與野生型p53非常相似的結(jié)構(gòu)和抗腫瘤功能。TAp73可以促進(jìn)骨肉瘤分化,抑制腫瘤惡變,特異性激活TAp73功能可以提高腫瘤對化療、放療的敏感性。而且已有相關(guān)研究認(rèn)為TAp73基因參與腫瘤自噬的調(diào)節(jié),但是其具體的作用機制尚且沒有完全被闡明。最為關(guān)鍵的是,與p53相比,TAp73表達(dá)非常穩(wěn)定,很少發(fā)生突變。有研究發(fā)現(xiàn)：在p53基因缺失的腫瘤細(xì)胞中特異性激活TAp73的功能,可以激活p53基因下游某些信號通路,從而抑制腫瘤的生長、發(fā)展,進(jìn)而促進(jìn)腫瘤凋亡。自噬通過抑制p53基因家族下游的信號通路達(dá)到對腫瘤的調(diào)節(jié)作用,而TAp73也參與p53基因家族抗腫瘤信號通路的調(diào)節(jié)。因此,TAp73跟腫瘤自噬之間是否存在一些聯(lián)系?研究TAp73與腫瘤自噬相關(guān)基因在人骨肉瘤中表達(dá)的關(guān)系可以為此解開TAp73和腫瘤自噬關(guān)系的神秘面紗,有助于進(jìn)一步探索TAp73調(diào)節(jié)腫瘤自噬的具體機制,為下一步深入研究提供基礎(chǔ)。自噬相關(guān)因子Beclin1是酵母自噬基因Atg6/Vps30的同源基因,也稱為BECN1,在腫瘤細(xì)胞自噬過程中發(fā)揮非常重要的作用。1998年,Liang等人在致死性Sinbis病毒性腦炎的大鼠中發(fā)現(xiàn)一種分子量為60kDa的蛋白質(zhì),與bcl-2的基因產(chǎn)物bcl-2相互作用,并能抑制sinbis病毒的復(fù)制,他們將這種蛋白質(zhì)的基因命名為Beclin1。Beclin1基因位于人染色體17q21,含有12個外子,Beclin1蛋白含有3個結(jié)構(gòu)域(BH3,CCD,ECD),這些結(jié)構(gòu)域是Beclin1與其他蛋白相互作用的部位。Beclin1是自噬體形成一個必需分子,它能夠介導(dǎo)其他自噬蛋白定位于自噬吞噬泡,從而調(diào)控哺乳動物自噬體的形成和成熟。在自噬過程中Beclin1表達(dá)水平往往是呈上升狀態(tài)。Beclin1的過表達(dá)可以使得磷脂酰肌醇3激酶家族Ⅲ表達(dá)上調(diào),而PI3KC1(p110α)及其下游的p-PKB表達(dá)下調(diào),進(jìn)而誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞自噬活性的增加,抑制腫瘤細(xì)胞的增殖和生長,產(chǎn)生抑癌效應(yīng)。Beclin1是腫瘤自噬調(diào)節(jié)中最主要的分子之一,它能夠通過不同的調(diào)節(jié)機制調(diào)節(jié)腫瘤自噬的活性,也就是說Beclin1在腫瘤中的表達(dá)是自噬活性的一種體現(xiàn),可以通過檢測Beclin1的表達(dá)情況描述腫瘤的自噬活性。Beclin1在臨床上很多腫瘤中的表達(dá)已經(jīng)有大量的文獻(xiàn)的,但是在人骨肉瘤中表達(dá)及其具體的調(diào)節(jié)尚未有具體的文獻(xiàn)做出詳細(xì)報道及闡述。本研究設(shè)計的優(yōu)勢：①TAp73屬于p53抗腫瘤基因家族。P53突變或缺失是骨肉瘤發(fā)生發(fā)展以及誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞耐藥的原因之一,同時,p53也是骨肉瘤的一個治療靶點。本研究通過探討TAp73與腫瘤自噬調(diào)節(jié)的關(guān)系,試圖尋找一種通過調(diào)節(jié)自噬治療骨肉瘤的精確途徑。②研究對象TAp73表達(dá)穩(wěn)定,不易發(fā)生突變,又與wt-p53結(jié)構(gòu)和抗腫瘤功能高度相似。以TAp73為切入點,通過探索其與細(xì)胞自噬的關(guān)系,不但可以調(diào)節(jié)TAp73的穩(wěn)定性及蛋白含量,激活其特異性功能,而且還可以調(diào)節(jié)細(xì)胞自噬活性,最終達(dá)到對腫瘤生長的抑制作用。③本課題的結(jié)果為下一步繼續(xù)探討TAp73調(diào)節(jié)自噬的機制提供研究基礎(chǔ)。本研究擬解決的問題：(1)TAp73、Beclin1蛋白在人骨肉瘤中表達(dá)是否對患者的預(yù)后產(chǎn)生影響?(2)在人骨肉瘤中TAp73蛋白表達(dá)是否對Beclin1蛋白表達(dá)是否存在某一種聯(lián)系?(3)在人骨肉瘤中TAp73和Beclin1蛋白兩者表達(dá)的相關(guān)性如何?圍繞上述幾個問題,本實驗利用免疫組化檢測TAp73、Beclin1在人骨肉瘤中的表達(dá)情況,結(jié)合骨肉瘤患者的臨床資料,運用統(tǒng)計學(xué)方法進(jìn)行分析,探討TAp73與細(xì)胞自噬的關(guān)系以及自噬在骨肉瘤中的作用,為臨床應(yīng)用提供實驗依據(jù)。方法：臨床收集48例骨肉瘤患者病例,采用定期采用電話或者預(yù)約回本院門診復(fù)診方式對患者進(jìn)行隨訪,并且詳細(xì)記錄所有骨肉瘤患者的病情進(jìn)展情況。通過免疫組化的方法將各個患者的病理標(biāo)本進(jìn)行切片觀察后,記錄TAp73、Beclin1的表達(dá)情況。結(jié)合患者的臨床資料,分析TAp73、Beclin1表達(dá)在性別、轉(zhuǎn)移、5年生存率的差異,并且利用統(tǒng)計學(xué)方法分析兩者在人骨肉瘤中表達(dá)的相關(guān)性。結(jié)果：1.TAp73、Beclin1陽性表達(dá)均有助于患者的預(yù)后在人骨肉瘤中,TAp73、Beclin1陽性表達(dá)與患者的生存時間呈正相關(guān)(r=0.673,P=0.000;r=0.388,P=0.003),TAp73、Beclin1陽性表達(dá)的患者的總體生存率優(yōu)于TAp73、Beclin1陰性表達(dá)的患者(80.8%vs50.0%,P=0.000; 80.0%vs44.4%,P=0.001),且TAp73、Beclin1的表達(dá)程度越高,患者的預(yù)后越好。綜合結(jié)果發(fā)現(xiàn),TAp73陽性表達(dá)能夠抑制腫瘤惡變,提高骨肉瘤的化療敏感性,有助于患者的預(yù)后；自噬活性上調(diào)有助于抑制骨肉瘤發(fā)展,誘導(dǎo)骨肉瘤細(xì)胞自噬死亡,自噬對骨肉瘤的調(diào)節(jié)是一種腫瘤抑制機制。2.TAp73促進(jìn)Beclin1蛋白的表達(dá)在人骨肉瘤中TAp73蛋白的陽性表達(dá)與陰性表達(dá),其Beclin1蛋白的表達(dá)程度不同(28.3519.95；Z=-2.146,P=0.032),兩種蛋白表達(dá)程度呈正相關(guān)(r=0.470,P=0.001)。結(jié)果分析：TAp73促進(jìn)Beclin1蛋白的表達(dá),即TAp73存在上調(diào)自噬活性的功能。所有的實驗數(shù)據(jù)均采用SPSS20.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,率之間的比較均采用x2分析,相關(guān)性分析均采用Spearman相關(guān)檢驗、Kaplan-Meier法計算本研究中所有患者總體生存率,生存率的比較采用Log-rank檢驗。P0.05視為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)論：1.骨肉瘤患者腫瘤組織中TAp73、Beclin1蛋白陽性表達(dá),可以抑制腫瘤的發(fā)展,有助于提高患者的總體生存率；2.骨肉瘤中TAp73、Beclin1的表達(dá)與患者的生存時間呈正相關(guān),表達(dá)程度越高,骨肉瘤患者的預(yù)后越好。3.在臨床工作中,檢測骨肉瘤患者TAp73、Beclin1蛋白的表達(dá),有助于對患者的預(yù)后的評估,協(xié)助臨床醫(yī)生調(diào)整術(shù)后的化療方案；4.在骨肉瘤中TAp73的陽性表達(dá),可以促進(jìn)Beclin1蛋白表達(dá),上調(diào)骨肉瘤細(xì)胞的自噬活性；5.TAp73是否能夠成為通過調(diào)節(jié)腫瘤自噬活性治療骨肉瘤新的治療靶點,需要進(jìn)一步探討TAp73調(diào)節(jié)自噬的具體機制。
【關(guān)鍵詞】：人骨肉瘤 自噬 TAp73 Beclin1 預(yù)后
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R738.1
【目錄】：

• 摘要3-9
• ABSTRACT9-19
• 第一章 前言19-26
• 第1節(jié) 研究背景19-24
• 第2節(jié) 研究目的、意義及內(nèi)容24-26
• 第二章 實驗部分26-54
• 第1節(jié) 資料與方法26-33
• 1.1 一般資料26-28
• 1.2 實驗設(shè)計28
• 1.3 實驗方法28-32
• 1.4 評分標(biāo)準(zhǔn)32-33
• 1.5 統(tǒng)計方法33
• 第2節(jié) 結(jié)果33-43
• 2.1 TAp73在骨肉瘤組織中的表達(dá)及患者的總體生存率情況33-37
• 2.2 Beclin1在骨肉瘤組織中的表達(dá)及患者的總體生存率情況37-41
• 2.3 TAp73陽性表達(dá)與Beclin1表達(dá)程度的關(guān)系41-42
• 2.4 在人骨肉瘤中TAp73和Beclin1表達(dá)程度的關(guān)系42-43
• 第3節(jié) 討論43-54
• 參考文獻(xiàn)54-66
• 全文總結(jié)66-67
• 實驗不足與展望67-68
• 中英文縮略詞對照表68-69
• 攻讀學(xué)位期間成果69-70
• 致謝70-72

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