本文關(guān)鍵詞：一氧化碳高壓干燥保存方法抗凋亡對移植心臟的保護(hù)作用

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【摘要】：研究背景心臟移植術(shù)是終末期心臟衰竭的治療手段之一。然而,供心不足成為了心臟移植術(shù)發(fā)展的瓶頸。即使現(xiàn)在,為了尋找捐獻(xiàn)的供心而遠(yuǎn)赴國外的患者及其家屬仍不在少數(shù)。然而事實上,國外的醫(yī)院也難以確保有充足的供體心臟以滿足日益增長的心臟移植術(shù)需求。因此,很多患者到了國外也不一定能接受心臟移植術(shù),患者及其家屬長時間的等待給社會及其家庭帶來了沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。供心供給不充分的重要原因之一,是供心無法長期保存。目前,供體心臟的保存方式普遍采用低溫保存液浸泡保存的方式。但由于細(xì)胞水腫、細(xì)胞酸中毒、代謝底物耗竭等原因,其保存的安全時限只有4-6小時。因此,尋找一種新的器官保存方法是具有必要性的。相關(guān)研究表明,缺血再灌注損傷(ischemia/reperfusion injury, IRI)是心臟移植最常見的病理過程,是導(dǎo)致移供體心臟術(shù)后早期功能不全的主要原因和晚期并發(fā)癥(如冠狀動脈血管病變)的主要相關(guān)因素。因此,減輕缺血再灌注損傷是心臟移植能否成功的關(guān)鍵。目前,大量的實驗和臨床資料均表明心肌細(xì)胞凋亡是心肌缺血再灌注過程中心肌損傷的重要病理學(xué)基礎(chǔ)之一,該病理生理過程受多種基因表達(dá)的調(diào)控,如Bcl-2、Bax和半胱氨酸天冬氨酸酶(Cysteine aspartase, Caspase)家族。因此,我們可以從抗心肌細(xì)胞凋亡途徑保護(hù)供體心臟,這將為心臟移植提供了新的研究角度。1998年,Seki等發(fā)現(xiàn)由40000個細(xì)胞組成、擁有神經(jīng)細(xì)胞的水熊蟲在體內(nèi)水分減少的狀態(tài)下,被暴露于6000個大氣壓的極限高靜水壓環(huán)境后復(fù)蘇并存活,并建議該成果能夠應(yīng)用于多細(xì)胞生物的保存。最初,Seki等通過使用全氟化碳(perfluorocarbon, PFC)溶液提供干燥環(huán)境保存離體小鼠心臟,然后再對離體心臟進(jìn)行復(fù)蘇,但發(fā)現(xiàn)實驗結(jié)果重復(fù)率并不理想。然而,這代表著一種全新的臟器保存方法——臟器干燥保存方法開始在實驗室得到運用。一氧化碳(Carbon Monoxide,CO)被認(rèn)為是一種毒性氣體,具有強烈的致命性。然而隨著一氧化氮作為氣體信使分子作用逐漸被發(fā)現(xiàn),同樣為氣體小分子的CO,其在體內(nèi)的生理作用也深受關(guān)注,CO成為第二種可以治療疾病的體內(nèi)重要信號分子。近年來研究表明,CO可以通過其血管舒張效應(yīng)、抗凝、抗凋亡、抗炎癥等機制發(fā)揮其對移植器官的缺血再灌注損傷的保護(hù)作用。因此,日本研究人員結(jié)合干燥保存臟器技術(shù)和CO對移植器官的缺血再灌注損傷現(xiàn)象具有保護(hù)作用的優(yōu)勢,發(fā)明CO高壓干燥保存這一全新方法,Yoshida等將離體小鼠心臟暴露在總壓力為2個標(biāo)準(zhǔn)大氣壓的不同比例混合氣體(CO和O2)當(dāng)中,放置在一個特制高壓罐保存24小時,通過降低水分和氣體環(huán)境的代謝抑制來提高心臟保存效果,然后再將離體心臟進(jìn)行頸部異位移植,結(jié)果發(fā)現(xiàn)在P02:PCO=4:1條件下,小鼠心臟復(fù)跳率最為理想(復(fù)跳率為80%)。隨后,Hatayama等用同樣的氣體干燥保存方法保存離體小鼠心臟,但混合氣體總壓力和比例有所不同(P02=3000hPa,PCO=4000hPa),心臟保存時間延長至48小時,結(jié)果發(fā)現(xiàn)小鼠心臟復(fù)跳率為100%。但是,上述的研究結(jié)果當(dāng)中的機制尚不明確,仍然停留在現(xiàn)象階段,并且實驗動物對象只停留在小鼠層面,檢測終點只有心臟復(fù)跳率、復(fù)跳心臟的心電圖等較為主觀的檢測指標(biāo),所以需要對CO高壓干燥保存方法的相關(guān)分子機制作進(jìn)一步的探究,這可以為這種全新的心臟保存方法的臨床研究提供科學(xué)依據(jù)。因此本研究在家兔腹腔異位移植基礎(chǔ)上,延長供心保存時間至18小時,探討CO高壓干燥保存方法抗移植心臟心肌細(xì)胞凋亡的效果及其可能機制。研究目的及意義在日方研究人員對CO高壓干燥心臟保存方法研究基礎(chǔ)上,本實驗采用新西蘭兔作為實驗動物,進(jìn)一步探討此方法在不同物種的可行性,同時驗證CO高壓干燥心臟保存方法抗心肌細(xì)胞凋亡的效果及其可能機制,為該方法的基礎(chǔ)研究提供科學(xué)依據(jù)。因此,通過中日科學(xué)家的合作,針對于改進(jìn)和完善供體臟器保護(hù)技術(shù),以及解決可供移植臟器嚴(yán)重不足這兩大突出問題,該實驗具有十分重要的意義。研究創(chuàng)新之處(1)以新西蘭兔作為實驗對象研究CO高壓干燥保存方法的保存效果。(2)本實驗采用新西蘭兔作為實驗動物,彌補了日方在CO高壓干燥心臟保存方法這一技術(shù)基礎(chǔ)只開展在小鼠層面的欠缺, 日方在前期實驗已確立CO高壓干燥保存方法在保存小鼠心臟方面的顯著效果,但檢測終點只有心臟復(fù)跳率、復(fù)跳心臟的心電圖等較為主觀的檢測指標(biāo),本實驗在蛋白層面初步探討CO高壓干燥保存方法可能的保存機制,同時驗證CO高壓干燥保存方法抗心肌細(xì)胞凋亡的效果及其可能機制,為該方法的基礎(chǔ)研究提供科學(xué)依據(jù)。研究方法(1)將48只新西蘭兔隨機分成三組,其中空白對照組(修剪好的供心后,立即將供心作移植處理)有8對,HTK浸泡組(將修剪好的供心放在無菌盤中水浴,用注射器將5m1的HTK溶液從主動脈緩慢地順灌到心肌中,再將心臟完全浸泡在裝有HTK溶液的玻璃皿當(dāng)中,最后將該玻璃皿放在4℃環(huán)境下保存18小時)有8對,CO高壓干燥組(將修剪好的供心放在無菌盤中水浴,用注射器將5m1的KH溶液(含有4倍高滲葡萄糖)從主動脈緩慢地順灌到心肌中,再將心臟懸掛于特制高壓氣體罐中緩慢加壓后保存18小時,其中總體壓力緩慢提升至4000hPa, PaO2::PaCO=4:1)有8對,其中特制CO高壓干燥保存罐見圖1-1。(2)建立兔心腹腔異位移植灌注模型,將新西蘭兔麻醉后切開后腹膜,沿著血管鞘鈍性分離并且暴露腹主動脈以及下腔靜脈。首先,在腹主動脈上選定理想吻合位置,用血管夾阻斷主動脈的上下兩端；其次,切開腹主動脈,切口大小應(yīng)該大于供體主動脈的口徑；最后用肝素水沖洗腹主動脈,將供體心臟主動脈和受體腹主動脈行端側(cè)吻合。同樣,上述相同操作用在供體心臟主肺動脈和受體下腔靜脈吻合上。開放血管夾檢查吻合口有無出血,若有出血,則需針對出血處進(jìn)行補針。等待心臟恢復(fù)規(guī)則有力搏動后,將其放置安穩(wěn),確保吻合的血管無扭曲以及壓迫。(3)待供體心臟復(fù)跳1小時后,測定各實驗組血清心肌酶(肌酸激酶(Creatine Kinase, CK)及同工酶(CK-MB)、乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase, LDH)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(Aspartate transaminase, AST)),取各實驗組供心的心肌組織后,用Wsetern免疫印跡法(Wstern Blot)法檢測移植術(shù)后心肌細(xì)胞Bcl-2/Bax和Caspase-3蛋白的表達(dá)情況,采用原位末端標(biāo)記染色法(Transferased UTP nick end labelling, TUNEL)檢測心肌細(xì)胞凋亡陽性率,利用蘇木素伊紅染色(Hematoxylin-Eosin staining, HE staining)評估心肌組織病理學(xué)改變。研究結(jié)果(1)與空白對照組相比,CO高壓干燥保存組、HTK浸泡組血清中CK、CK-MB、LDH、AST含量均顯著增多。而與HTK浸泡組,CO高壓干燥保存組血清中CK、CK-MB、LDH、AST含量均顯著減少(P0.05)(2)與空白對照組相比,CO高壓干燥保存組、HTK浸泡組的心肌細(xì)胞Caspase-3表達(dá)均顯著增多,而Bcl-2/Bax表達(dá)均顯著減少(P0.05)。與HTK浸泡組,CO高壓干燥保存組的心肌細(xì)胞Caspase-3表達(dá)均顯著減少,而Bcl-2/Bax表達(dá)均顯著增大(P0.05)。(3)與空白對照組相比,CO高壓干燥保存組、HTK浸泡組的心肌組織凋亡細(xì)胞陽性率均顯著增多(P0.05),而與HTK浸泡組,CO高壓干燥保存組的心肌組織凋亡細(xì)胞陽性率均顯著減少(P0.05)(4)光鏡觀察顯示：與CO高壓干燥組和HTK浸泡組相比,空白對照組間質(zhì)水腫較為明顯,心肌細(xì)胞斷裂、溶解較少,細(xì)胞核多為飽滿、圓狀。而與CO高壓干燥組相比,HTK浸泡組可見更多的溶解、斷裂的心肌細(xì)胞,且胞質(zhì)水腫、細(xì)胞核固縮、溶解及消失更明顯。研究結(jié)論與傳統(tǒng)的HTK浸泡保存供心方法相比,CO高壓干燥保存方法更能通過抗心肌細(xì)胞凋亡從而提高供心保存效果,這通過調(diào)節(jié)Bcl-2/Bax蛋白表達(dá)比值,抑制Caspase-3的激活,從而抑制缺血再灌注后心肌細(xì)胞的凋亡,但具體機制仍有待于進(jìn)一步研究。
【關(guān)鍵詞】：心臟移植 器官保存 一氧化碳 干燥 凋亡
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R654.2
【目錄】：

• 摘要3-7
• ABSTRACT7-15
• 第一章 一氧化碳高壓干燥保存方法抗凋亡對移植心臟的保護(hù)作用15-49
• 前言15-25
• 1.1. 實驗材料與方法25-38
• 1.1.1. 實驗動物與分組25
• 1.1.2. 主要試劑和儀器25-27
• 1.1.3. 離體心臟的獲取27-28
• 1.1.4. 供體心臟的保存28
• 1.1.5. 兔心腹腔異位移植模型的建立28-29
• 1.1.6. 移植后觀察的指標(biāo)29-38
• 1.2. 數(shù)據(jù)統(tǒng)計及分析38
• 1.3. 實驗結(jié)果38-44
• 1.3.1. 各組實驗前的情況38-39
• 1.3.2. 心臟復(fù)跳1小時后三組血清中心肌酶CK、CK-MB、LDH、AST含量比較39-40
• 1.3.3. 心臟復(fù)跳1小時后三組心肌組織中caspase-3、Bax/Bcl-2表達(dá)的比較40-41
• 1.3.4. 心臟復(fù)跳1小時后三組心肌組織調(diào)亡細(xì)胞陽性率比較41-42
• 1.3.5. 心臟復(fù)跳1小時后三組心肌組織病理學(xué)改變42-44
• 1.4. 討論44-48
• 1.5. 結(jié)論48-49
• 參考文獻(xiàn)49-52
• 攻讀碩士期間成果52-53
• 致謝53-54
• 附錄 縮略詞表54-55

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本文編號：624747