本文關(guān)鍵詞：壓力對小鼠成骨細(xì)胞增殖活性影響的基因表達(dá)譜差異分析

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【摘要】：目的:在整個生長發(fā)育的過程中,機(jī)械力刺激無時無刻不在對機(jī)體產(chǎn)生著巨大的作用,尤其體現(xiàn)在骨骼發(fā)育、骨折愈合、骨改建等方面。在骨形成過程中,成骨細(xì)胞起著至關(guān)重要的作用,且對外界力學(xué)刺激敏感。以往學(xué)者認(rèn)為,壓力能促進(jìn)骨的吸收,不利于骨的形成。然而近年來,越來越多的研究表明,適合的壓力可能會促進(jìn)成骨細(xì)胞的增殖分化,進(jìn)而對骨的形成起一定促進(jìn)作用,但目前的研究對成骨細(xì)胞受到力學(xué)刺激后細(xì)胞內(nèi)生物力學(xué)信號的轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制尚不明確。本實驗通過體外培養(yǎng)小鼠胚胎成骨細(xì)胞MC3T3-E1形成3D細(xì)胞薄膜,利用FX-5000C壓力加載系統(tǒng)對其施加10%壓縮率,MTT法檢測壓力對小鼠成骨細(xì)胞增殖活性的作用,并利用Affymetrix基因表達(dá)譜芯片技術(shù),分析壓力對小鼠成骨細(xì)胞差異基因表達(dá)的影響,探討壓力對成骨細(xì)胞的作用機(jī)制,為臨床研究骨改建的機(jī)理以及相關(guān)疾病的治療和恢復(fù)提供理論依據(jù)和實驗參考。方法:1小鼠成骨細(xì)胞MC3T3-E1體外培養(yǎng)復(fù)蘇凍存的原代小鼠胚胎成骨細(xì)胞MC3T3-E1,鏡下觀察細(xì)胞生長情況,待細(xì)胞長滿瓶底,且生長狀況良好時進(jìn)行細(xì)胞傳代。選取狀態(tài)良好、呈對數(shù)期生長的MC3T3-E1細(xì)胞,制備成單細(xì)胞懸液,以1×105細(xì)胞/孔接種到12培養(yǎng)孔板上,培養(yǎng)28天,形成一層厚度約1~2 mm的3D細(xì)胞薄膜備用。2小鼠成骨細(xì)胞體外加載模型的建立收集3D細(xì)胞薄膜,滴入到6個6孔壓力培養(yǎng)板中,將6個6孔壓力培養(yǎng)板隨機(jī)分為實驗組1小時(A1組)、4小時(B1組)、8小時(C1組),對照組1小時(A2組)、4小時(B2組)、8小時(C2組)。利用FX-5000C細(xì)胞壓力加載系統(tǒng)對實驗組施加頻率為1 Hz(正弦波形),10%的壓縮率,分別加壓1、4、8小時,對照組不加力,同樣條件下培養(yǎng)1、4、8小時。3小鼠成骨細(xì)胞增殖活性的檢測加力結(jié)束后,使用MTT法檢測各組細(xì)胞的增殖情況,用酶聯(lián)免疫檢測儀在490 nm處檢測各組細(xì)胞的吸光度值(optical density,OD值),記錄數(shù)據(jù),并使用SPSS 21.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。4小鼠成骨細(xì)胞總RNA的提取選取增殖活性最強(qiáng)的實驗組和相應(yīng)對照組的細(xì)胞,使用TRIZOL法提取細(xì)胞的總RNA,測定RNA的純度、濃度及完整性。5小鼠成骨細(xì)胞基因芯片的制備及檢測將提取的總RNA標(biāo)本制備全基因組表達(dá)譜芯片,繼而進(jìn)行芯片的洗染和掃描,對得出數(shù)據(jù)進(jìn)行檢測并用Transcriptome Analysis Console 3.0分析軟件對結(jié)果進(jìn)行分析,篩選差異基因。結(jié)果:1細(xì)胞增殖活性MTT實驗結(jié)果對成骨細(xì)胞加壓1、4、8小時后,各實驗組與相應(yīng)對照組吸光度均值(以x±SD表示),A1組:0.323±0.047,A2組:0.307±0.034;B1組:0.850±0.060,B2組:0.313±0.027;C1組:0.530±0.081,C2組:0.307±0.025;A1組與A2組吸光度值比較無統(tǒng)計學(xué)差異(P0.05);B1組與B2組吸光度值比較有統(tǒng)計學(xué)差異(P0.001);C1組與C2組吸光度值比較有統(tǒng)計學(xué)差異(P0.001);三個對照組細(xì)胞吸光度值無統(tǒng)計學(xué)差異(P0.05);三個實驗組細(xì)胞吸光度值比較有統(tǒng)計學(xué)差異(P0.05)。MTT結(jié)果表明:加力1小時時,實驗組與對照組成骨細(xì)胞的增殖活性沒有顯著差異;加力4小時時,成骨細(xì)胞的增殖活性達(dá)到高峰,隨著加力時間的延長,細(xì)胞的增殖活性逐漸降低。2總RNA的濃度、純度及完整性檢測利用Nanodrop 2000/2000 C分光光度計測定結(jié)果顯示:B1組(加力4小時組)與B2組(4小時對照組)總RNA的OD260/OD280比值均位于1.8~2.0之間,純度及濃度符合實驗要求。凝膠電泳結(jié)果顯示:B1組(加力4小時組)與B2組(4小時對照組)RNA經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后利用全自動凝膠成像系統(tǒng)(GBOXF3)分析,可見三個條帶出現(xiàn),28 S條帶亮度約為18 S條帶亮度的兩倍,5 S條帶較淡,說明各組提取的總RNA完整性良好,符合實驗要求。3小鼠胚胎成骨細(xì)胞MC3T3-E1全基因組m RNA表達(dá)譜差異分析在所分析的34472條小鼠全組基因中,篩選出基因信號上調(diào)和下調(diào)2倍及以上差異的全部基因,B1組(加力4小時組)與B2組(4小時對照組)成骨細(xì)胞之間差異表達(dá)顯著的基因共出現(xiàn)3609條,其中上調(diào)的基因有1657條,下調(diào)的基因有1952條,這些基因的產(chǎn)物涉及細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、增殖、分化、凋亡等多個方面。結(jié)論:1對成骨細(xì)胞施加適當(dāng)?shù)膲毫皶r間,能增強(qiáng)成骨細(xì)胞的增殖活性。2壓力下成骨細(xì)胞基因表達(dá)譜發(fā)生改變,Myc、Jun、Fos、Runx2、Wnt10b、Lrp5等成骨相關(guān)基因顯著上調(diào)。3 Myc、Jun、Fos、Runx2、Wnt10b、Lrp5等成骨相關(guān)基因可能主要通過TGF-β信號通路和Wnt信號通路來促進(jìn)成骨細(xì)胞的增殖分化。
【關(guān)鍵詞】：成骨細(xì)胞 壓力 增殖活性 基因芯片 3D細(xì)胞薄膜
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R68
【目錄】：

• 中文摘要4-7
• 英文摘要7-11
• 前言11-12
• 材料與方法12-24
• 結(jié)果24-26
• 附圖26-32
• 附表32-54
• 討論54-58
• 結(jié)論58-59
• 參考文獻(xiàn)59-61
• 綜述 壓力對成骨細(xì)胞增殖分化影響的研究現(xiàn)狀61-70
• 參考文獻(xiàn)67-70
• 致謝70-71
• 個人簡歷71

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前3條

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2 鄭翼,陳國平,周征,羅頌椒;機(jī)械壓力對成骨樣細(xì)胞增殖活性及功能狀態(tài)的影響[J];華西口腔醫(yī)學(xué)雜志;2002年01期

3 毛勇,段小紅,王忠義,張玉梅;不同應(yīng)力對成骨細(xì)胞和細(xì)胞骨架影響的實驗研究[J];牙體牙髓牙周病學(xué)雜志;2001年02期

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本文編號：621874