發(fā)布時(shí)間：2017-07-21 05:07

  本文關(guān)鍵詞：NOV的差異表達(dá)對(duì)人骨肉瘤細(xì)胞系增殖、凋亡和遷移的影響及機(jī)制研究

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【摘要】：目的檢測(cè)人骨肉瘤細(xì)胞系中腎母細(xì)胞瘤過表達(dá)(nephroblastoma overexpressed,NOV)基因的表達(dá)水平;采用腺病毒介導(dǎo)的基因過表達(dá)或干擾技術(shù)探討NOV對(duì)人骨肉瘤細(xì)胞株143B和MG63增殖、凋亡和遷移等作用的影響,并對(duì)其作用的分子機(jī)制進(jìn)行初步研究。方法1.人骨肉瘤細(xì)胞系中NOV的表達(dá)水平檢測(cè):以本實(shí)驗(yàn)室保存的4種人骨肉瘤細(xì)胞株(143B、U2OS、MG63和SaOS2)為研究對(duì)象,分別采用半定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR)和蛋白質(zhì)印跡(Western blot)檢測(cè)各細(xì)胞中NOV的表達(dá)水平,從而確定不同類型人骨肉瘤細(xì)胞的差異表達(dá)。2.重組腺病毒的感染效率驗(yàn)證:攜帶人NOV過表達(dá)基因的重組腺病毒Ad-NOV及其空載體陰性對(duì)照Ad-GFP和表達(dá)針對(duì)人NOV的siRNA的重組腺病毒Ad-siNOV及其陰性對(duì)照Ad-RFP分別用于感染對(duì)應(yīng)的低表達(dá)和高表達(dá)NOV的人骨肉瘤細(xì)胞株,熒光顯微鏡下觀察病毒感染效率,并通過RT-PCR和Western blot驗(yàn)證NOV在mRNA和蛋白水平的表達(dá)或干擾效果。3.nov的差異表達(dá)對(duì)人骨肉瘤143b和mg63細(xì)胞增殖、凋亡和遷移能力的影響:143b和mg63細(xì)胞經(jīng)病毒處理相應(yīng)時(shí)間后,采用mtt法、克隆形成實(shí)驗(yàn)和流式細(xì)胞術(shù)(fcm)檢測(cè)細(xì)胞增殖能力的改變;hochest33258染色和fcm用于檢測(cè)細(xì)胞的凋亡水平;通過劃痕實(shí)驗(yàn)和transwell小室法檢測(cè)對(duì)細(xì)胞遷移及侵襲能力的影響。此外,進(jìn)一步采用rt-pcr和westernblot檢測(cè)細(xì)胞中凋亡相關(guān)蛋白bcl-2和bax以及與遷移密切相關(guān)的基質(zhì)金屬蛋白酶(matrixmetalloproteinase,mmp)家族的表達(dá)變化,以反映細(xì)胞的凋亡和遷移能力改變。4.nov的差異表達(dá)對(duì)人骨肉瘤143b和mg63細(xì)胞中信號(hào)通路的影響:病毒處理143b和mg63細(xì)胞48h后,采用rt-pcr和westernblot檢測(cè)整合素受體家族的表達(dá);熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒檢測(cè)異�；罨男盘�(hào)分子,westernblot檢測(cè)pi3k/akt、mapk及下游ap-1等相關(guān)蛋白的磷酸化水平,從而明確nov作用于人骨肉瘤細(xì)胞的信號(hào)通路。5.mapk信號(hào)通路在nov誘導(dǎo)的骨肉瘤143b細(xì)胞增殖、凋亡和遷移中的作用:應(yīng)用mapk/p38的抑制劑sb203580和mapk/jnk的抑制劑sp600125分別處理143b細(xì)胞,westernblot檢測(cè)p-p38和p-jnk的表達(dá)水平,驗(yàn)證抑制劑的效率;細(xì)胞經(jīng)抑制劑處理相應(yīng)時(shí)間后,采用mtt法檢測(cè)細(xì)胞活力,transwell小室法檢測(cè)細(xì)胞遷移能力的變化,并通過westernblot檢測(cè)細(xì)胞中凋亡相關(guān)蛋白bcl-2和bax表達(dá)的改變。結(jié)果1.4株骨肉瘤細(xì)胞株經(jīng)rt-pcr檢測(cè)后結(jié)果顯示,nov的表達(dá)存在明顯的差異,其中在143b細(xì)胞中的表達(dá)水平最低,在saos2和u2os細(xì)胞中有一定程度的表達(dá),而在mg63細(xì)胞中表達(dá)水平為最高。westernblot結(jié)果得到的nov蛋白表達(dá)水平與mrna結(jié)論基本一致。2.143b和mg63細(xì)胞經(jīng)相對(duì)應(yīng)的腺病毒感染24-36h后,熒光顯微鏡下可見細(xì)胞中綠色和紅色熒光蛋白表達(dá)有所增強(qiáng),鏡下判斷腺病毒在細(xì)胞中的感染效率達(dá)到60-70%。rt-pcr和westernblot結(jié)果顯示143b細(xì)胞中ad-nov組的nov的表達(dá)明顯高于ad-gfp組(p0.01)和空白對(duì)照組(p0.05);mg63細(xì)胞中ad-sinov組的nov灰度值則顯著低于ad-rfp組和空白對(duì)照組(p0.05)。結(jié)果提示nov在mrna和蛋白水平均被成功過表達(dá)或干擾。3.增殖能力相關(guān)檢測(cè)結(jié)果顯示,143b細(xì)胞中ad-nov組的細(xì)胞增殖能力在48h受到了抑制(p0.05),并且該抑制作用在72h表現(xiàn)的更為顯著(p0.01);克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果亦有類似的發(fā)現(xiàn),ad-nov組的細(xì)胞克隆形成能力比對(duì)照組降低了23%(p0.01);fcm結(jié)果證實(shí)nov的過表達(dá)導(dǎo)致了143b細(xì)胞的周期阻滯。與之相反,在mg63細(xì)胞中,一系列實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示ad-sinov組中細(xì)胞的增殖能力(p0.01),克隆形成能力(p0.05)都有所增強(qiáng),對(duì)于細(xì)胞周期也有一定程度的促進(jìn)。凋亡水平相關(guān)檢測(cè)結(jié)果顯示,143b細(xì)胞經(jīng)ad-nov處理48h后發(fā)生早期凋亡的細(xì)胞所占比例顯著高于ad-gfp對(duì)照組(p0.01),細(xì)胞核染色質(zhì)經(jīng)hochest33258染色也表現(xiàn)出明顯的聚集現(xiàn)象。同時(shí),rt-pcr和westernblot結(jié)果顯示ad-nov組細(xì)胞促凋亡因子bax表達(dá)上調(diào)(p0.01),抗凋亡因子bcl-2表達(dá)下降(p0.05)。反之在mg63細(xì)胞中,經(jīng)ad-sinov處理后發(fā)生凋亡的細(xì)胞數(shù)目減少(p0.05),細(xì)胞核染色質(zhì)的聚集程度減弱,bax和bcl-2的表達(dá)水平也表現(xiàn)出與143b細(xì)胞中相反的現(xiàn)象。劃痕實(shí)驗(yàn)和transwell分析顯示,ad-nov感染后的143b細(xì)胞遷移能力明顯增強(qiáng),細(xì)胞的穿膜數(shù)目相對(duì)于對(duì)照組有所上升;rt-rcr結(jié)果進(jìn)一步顯示遷移促進(jìn)因子mmp蛋白家族的表達(dá)在ad-nov組細(xì)胞中增強(qiáng)。而ad-sinov感染后mg63細(xì)胞的表現(xiàn)與上述內(nèi)容恰恰相反。4.rt-pcr和westernblot結(jié)果顯示,在ad-nov感染的143b細(xì)胞中,整合素受體αv和β3的mrna和蛋白表達(dá)水平都有上調(diào);熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)結(jié)果提示細(xì)胞中ap-1和nf-κb信號(hào)分子異常活化。此外,p38和jnk的磷酸化水平在ad-nov組細(xì)胞中均有明顯上調(diào),而p-akt則無(wú)改變。在ad-sinov感染的mg63細(xì)胞中,無(wú)論是整合素受體還是信號(hào)分子的磷酸化水平都表現(xiàn)為下降趨勢(shì)。5.使用mapk/p38的抑制劑sb203580和mapk/jnk的抑制劑sp600125分別處理143b細(xì)胞后,westernblot結(jié)果顯示細(xì)胞中p-p38和p-jnk的表達(dá)水平相比ad-nov組均有下調(diào),提示sb203580和sp600125有效抑制了143b細(xì)胞中由于nov過表達(dá)而激活的mapk/p38和mapk/jnk信號(hào)通路。mtt結(jié)果顯示經(jīng)抑制劑作用后的143b細(xì)胞增殖能力減弱,低于未經(jīng)抑制劑作用的ad-nov組;transwell分析提示sb203580和sp600125能夠部分抑制nov過表達(dá)誘導(dǎo)的細(xì)胞遷移。westernblot結(jié)果顯示使用抑制劑后,ad-nov組細(xì)胞中bax表達(dá)的上調(diào)趨勢(shì)被削弱,而bcl-2的表達(dá)則有所恢復(fù),進(jìn)一步證實(shí)細(xì)胞凋亡水平被抑制。結(jié)論1.4種人骨肉瘤細(xì)胞株中NOV的表達(dá)水平存在明顯的差異。2.NOV的過表達(dá)能夠抑制人骨肉瘤細(xì)胞的增殖能力,而在一定程度上促進(jìn)細(xì)胞的凋亡和遷移。3.NOV能夠上調(diào)人骨肉瘤細(xì)胞表面的整合素受體表達(dá),進(jìn)而激活MAPK/p38和MAPK/JNK信號(hào)通路,但對(duì)PI3K/Akt通路無(wú)明顯影響。4.骨肉瘤細(xì)胞中MAPK/p38和MAPK/JNK信號(hào)通路的活化參與調(diào)控NOV對(duì)該細(xì)胞的增殖、凋亡和遷移作用。
【關(guān)鍵詞】：NOV 骨肉瘤 整合素受體 p38/JNK信號(hào)通路
【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R738.1
【目錄】：

• 英漢縮略語(yǔ)名詞對(duì)照4-6
• 中文摘要6-11
• 英文摘要11-17
• 前言17-18
• 第一部分 NOV在人骨肉瘤細(xì)胞系中的表達(dá)水平18-25
• 1 材料與方法18-23
• 2 結(jié)果23-24
• 3 討論24-25
• 第二部分 NOV對(duì)人骨肉瘤細(xì)胞系增殖、凋亡和遷移的影響25-35
• 1 材料與方法25-28
• 2 結(jié)果28-33
• 3 討論33-35
• 第三部分 NOV作用于人骨肉瘤細(xì)胞系的機(jī)制研究35-43
• 1 材料與方法35-36
• 2 結(jié)果36-41
• 3 討論41-43
• 全文總結(jié)43-44
• 參考文獻(xiàn)44-47
• 文獻(xiàn)綜述47-55
• 參考文獻(xiàn)51-55
• 致謝55-56
• 攻讀碩士期間發(fā)表的論文56

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2 易成臘;李新志;徐衛(wèi)國(guó);陳安民;;腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)基因1在人骨肉瘤細(xì)胞的表達(dá)與轉(zhuǎn)移侵襲的關(guān)系[J];中華實(shí)驗(yàn)外科雜志;2006年04期

3 鄭強(qiáng),范清宇;白細(xì)胞介素-2基因轉(zhuǎn)染人骨肉瘤細(xì)胞的體外生物學(xué)特性[J];第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào);1999年02期

4 寶建中,陶文照,肖輝,倪燦榮;裸小鼠人骨肉瘤細(xì)胞移植瘤株建立及其特性觀察[J];腫瘤;1993年02期

5 劉光,高奉潯,王東,馮素珍;人骨肉瘤細(xì)胞浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移相關(guān)表型的研究[J];第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào);1997年06期

6 王洪,杜靖遠(yuǎn),羅懷燦,劉國(guó)平;人骨肉瘤細(xì)胞體外藥物敏感性的實(shí)驗(yàn)研究[J];同濟(jì)醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào);1998年02期

7 潘朝暉,范清宇,殷劍寧,蔣維中,張殿中;裸小鼠原位移植篩選高轉(zhuǎn)移性人骨肉瘤細(xì)胞系及其生物學(xué)特性分析[J];細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志;2000年03期

8 樓列名;吳興;顧昕;劉珊林;;錳型超氧化物歧化酶基因轉(zhuǎn)染對(duì)人骨肉瘤細(xì)胞的誘導(dǎo)凋亡作用[J];上海醫(yī)學(xué);2007年06期

9 李星星;何煥玲;吳麗美;左國(guó)偉;苗靜琨;周蘭;;人骨形態(tài)發(fā)生蛋白12對(duì)人骨肉瘤細(xì)胞的生物學(xué)作用[J];生命科學(xué)研究;2008年04期

10 吳進(jìn);楊彤濤;甘璐;周勇;;電壓門控性鉀離子通道對(duì)人骨肉瘤細(xì)胞增殖的影響[J];科學(xué)技術(shù)與工程;2009年16期

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1 辛曾峰;鄭強(qiáng);;藤黃酸抑制人骨肉瘤細(xì)胞系侵襲性的體外研究[A];2012年浙江省骨科學(xué)術(shù)年會(huì)論文集[C];2012年

2 寶建中;陶文照;肖輝;倪燦榮;;裸小鼠人骨肉瘤細(xì)胞移植模型的建立及其特性觀察[A];中國(guó)細(xì)胞生物學(xué)學(xué)會(huì)第五次會(huì)議論文摘要匯編[C];1992年

3 楊彤濤;張勇;李存孝;黃立軍;周勇;范清宇;馬保安;;反義RNA抑制Survivin在人骨肉瘤細(xì)胞系MG63中表達(dá)的實(shí)驗(yàn)研究[A];全國(guó)骨科臨床研究新進(jìn)展研討會(huì)暨學(xué)習(xí)班論文集[C];2006年

4 何煥玲;左國(guó)偉;賴天霞;王嫣;陳小菊;李星星;苗靜琨;譚啟華;寇小琴;周蘭;;骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2和-6對(duì)人骨肉瘤細(xì)胞U2OS作用的研究[A];第四屆中國(guó)腫瘤學(xué)術(shù)大會(huì)暨第五屆海峽兩岸腫瘤學(xué)術(shù)會(huì)議論文集[C];2006年

5 熊文化;龐清江;楊長(zhǎng)春;袁欣華;陳曉牛;;PIN1反義基因轉(zhuǎn)染抑制人骨肉瘤細(xì)胞的增殖[A];2006年浙江省骨科學(xué)術(shù)會(huì)議暨浙江省脊柱脊髓學(xué)術(shù)會(huì)議論文匯編[C];2006年

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1 鄭強(qiáng);白細(xì)胞介素-2真核表達(dá)載體的構(gòu)建及其在人骨肉瘤細(xì)胞系內(nèi)的表達(dá)的實(shí)驗(yàn)研究[D];第四軍醫(yī)大學(xué);1998年

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1 姚娟;NOV的差異表達(dá)對(duì)人骨肉瘤細(xì)胞系增殖、凋亡和遷移的影響及機(jī)制研究[D];重慶醫(yī)科大學(xué);2016年

2 仇超;Id1基因?qū)θ斯侨饬黾?xì)胞MG63惡性逆轉(zhuǎn)向成骨分化的影響及作用機(jī)制[D];重慶醫(yī)科大學(xué);2016年

3 吳進(jìn);人骨肉瘤細(xì)胞與電壓門控性鉀離子通道關(guān)系的研究[D];第四軍醫(yī)大學(xué);2009年

4 李天強(qiáng);免疫球蛋白重鏈結(jié)合蛋白在人骨肉瘤細(xì)胞中的表達(dá)及臨床意義[D];山東中醫(yī)藥大學(xué);2010年

5 周峰;二甲雙胍聯(lián)合阿霉素對(duì)人骨肉瘤細(xì)胞抑制作用的實(shí)驗(yàn)研究[D];中南大學(xué);2014年

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10 迮仁浩;人骨肉瘤細(xì)胞中S100A6蛋白的表達(dá)及其意義[D];華中科技大學(xué);2007年

本文編號(hào)：571516