本文關(guān)鍵詞：人源性脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞治療視神經(jīng)損傷的臨床前研究

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【摘要】：外傷性視神經(jīng)損傷(traumatic optic neuropathy(TON))是顱腦外傷的一個(gè)嚴(yán)重的并發(fā)癥,可部分或者完全造成視力喪失,顱腦外傷中大約有0.7-6%的患者合并視神經(jīng)損傷。目前,在全世界范圍內(nèi)仍然沒有一種公認(rèn)的標(biāo)準(zhǔn)化治療方案,也沒有隨機(jī)對(duì)照雙盲實(shí)驗(yàn)來證實(shí)各種治療方式的優(yōu)缺點(diǎn)。視神經(jīng)屬于中樞神經(jīng)系統(tǒng)的一部分,損傷以后無法再生或者再生能力極其有限,目前在臨床實(shí)踐中主要使用激素、改善微循環(huán)、神經(jīng)營養(yǎng)等保守治療和視神經(jīng)減壓術(shù)相結(jié)合的方法,但是治療結(jié)果仍不滿意。近年來,隨著干細(xì)胞技術(shù)的蓬勃發(fā)展,干細(xì)胞應(yīng)用于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和人體實(shí)驗(yàn)并取得顯著的成果,在治療各種疾病中的優(yōu)勢(shì)逐漸顯現(xiàn)。在治療視神經(jīng)方面,已經(jīng)有學(xué)者將神經(jīng)干細(xì)胞、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞、臍帶血干細(xì)胞、牙髓間充質(zhì)干細(xì)胞等細(xì)胞應(yīng)用于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床實(shí)驗(yàn)中,并取得了令人鼓舞的成果。人源性脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞(human Adipose-derived stem cells(hADSCs))在人體內(nèi)含量豐富,獲取方便、體外純化度高、擴(kuò)增能力強(qiáng)等多方面優(yōu)點(diǎn),被越來越多的基礎(chǔ)和臨床研究所關(guān)注。脂肪組織被認(rèn)為是多潛能干細(xì)胞可供選擇的來源,大量證據(jù)表明,在體外特定條件下,脂肪干細(xì)胞不僅能分化為內(nèi)胚層細(xì)胞系,而且能分化為中胚層,外胚層細(xì)胞系,如骨細(xì)胞,軟骨細(xì)胞,脂肪細(xì)胞,神經(jīng)細(xì)胞等。最近,脂肪干細(xì)胞被認(rèn)為是最有前景的一種成體干細(xì)胞,其可以從抽吸術(shù)中安全大量的獲得,可用于再生醫(yī)學(xué)的研究。許多患者擁有過剩的脂肪,應(yīng)用無創(chuàng)和無痛的方法可獲得大量的脂肪,脂肪干細(xì)胞來源的神經(jīng)祖細(xì)胞為神經(jīng)系統(tǒng)疾病的細(xì)胞治療帶來了希望。大量的基礎(chǔ)研究證實(shí)hADSCs有保護(hù)視神經(jīng)和損傷修復(fù)作用并且在臨床應(yīng)用中顯示出美好的臨床應(yīng)用前景,使之成為理想的移植細(xì)胞。但是干細(xì)胞屬于異源性細(xì)胞,存在免疫排斥反應(yīng)、致瘤性等相關(guān)問題并且我們對(duì)hADSCs的生物學(xué)特性并不是完全清楚,對(duì)于體外擴(kuò)增的hADSCs是否會(huì)影響其臨床使用的安全性問題還缺乏相關(guān)的研究。本實(shí)驗(yàn)選擇視神經(jīng)鉗夾損傷動(dòng)物模型,分別采用尾靜脈和視神經(jīng)損傷部位注射hADSCs,觀察hADSCs對(duì)RGCs的保護(hù)作用和對(duì)GAP43、GFAP的表達(dá)影響以及對(duì)視神經(jīng)軸突再生和軸突運(yùn)輸?shù)淖饔?探討hADSCs對(duì)全身的毒性和炎癥因子的影響,為評(píng)估體外擴(kuò)增的hADSCs作為臨床使用的安全性問題提供重要的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。一、大鼠視神經(jīng)鉗夾損傷動(dòng)物模型的建立和評(píng)價(jià)目的:1、建立大鼠視神經(jīng)鉗夾損傷動(dòng)物模型。2、明確大鼠視神經(jīng)損傷后RGCs數(shù)量的動(dòng)態(tài)變化規(guī)律。3、探討大鼠急性視神經(jīng)損傷后GAP43和GFAP在視神經(jīng)和視網(wǎng)膜中的變化規(guī)律。方法:SD(Sprague Dawley,SD)大鼠24只,體重為220-250g按照文獻(xiàn)方法,使用3g/100ml濃度的水合氯醛腹腔麻醉大鼠。麻醉成功后使用外科顯微手術(shù)器械,在大鼠右眼上瞼靠后作垂直切口,向上延伸1cm左右,眼科剪剪開穹窿部結(jié)膜,鈍性分離并暴露視神經(jīng),動(dòng)脈瘤夾夾持視神經(jīng),時(shí)間為5s,松開動(dòng)脈瘤夾后觀察大鼠瞳孔情況,如果瞳孔散大,直接對(duì)光反射消失、間接對(duì)光反射存在,且眼底鏡觀察眼底后,明確未損傷大鼠眼動(dòng)脈、眼底供血情況良好,大鼠視神經(jīng)鉗夾損傷模型制作成功,納入實(shí)驗(yàn)組。視神經(jīng)損傷動(dòng)物模型建立后,分別于傷后3天,7天,14天,28天,動(dòng)物使用多聚甲醛灌注后取眼球和視神經(jīng)分別行HE染色、RGCs計(jì)數(shù)、TUJ-1、GAP43和GFAP免疫熒光染色,并比較5組之間的差異。結(jié)果:1、視神經(jīng)損傷后第3天,HE染色示損傷部位空泡化,少量炎性細(xì)胞侵潤,視神經(jīng)鞘膜完整,第14天可見大量的炎性細(xì)胞侵潤和部分血管增生,第28天可見視神經(jīng)萎縮變細(xì)和膠質(zhì)瘢痕增生。2、視神經(jīng)損傷后第3天,RGCs無明顯變化,第7天、第14天、第28天明顯下降,分別減少10.12%,30.5%,45.75%,61.87%。TUJ-1標(biāo)記的陽性RGCs表現(xiàn)出相似的變化,分別下降6.62%,31.12%,46.23%,62.25%。3、正常視神經(jīng)GAP43表達(dá)量極少或者不表達(dá),損傷后在損傷部位近端GAP43開始表達(dá),第7天達(dá)到高峰,第14天有所下降,第28天明顯下降。視網(wǎng)膜GAP-43的表達(dá)也表現(xiàn)出與視神經(jīng)類似的變化,第3天開始升高,第7天達(dá)到高峰,第14天開始下降,第28天明顯下降。4、視神經(jīng)損傷后,損傷區(qū)域GFAP免疫熒光強(qiáng)度明顯下降,損傷近端GFAP免疫熒光強(qiáng)度在第3天開始增加,到第7天左右達(dá)到高峰,第28天明顯下降;眼球視網(wǎng)膜GFAP免疫熒光強(qiáng)度在第3天開始增加,到第7天左右達(dá)到高峰,第28天明顯下降。結(jié)論:大鼠視神經(jīng)鉗夾損傷動(dòng)物模型穩(wěn)定性良好、操作簡(jiǎn)單、可重復(fù)性高、可操作性強(qiáng),可在一般無菌動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室內(nèi)完成;該動(dòng)物模型可有效模擬臨床外傷性視神經(jīng)損傷患者的病理生理變化規(guī)律、致傷原理以及臨床相關(guān)癥狀。二、hADSCs對(duì)大鼠視神經(jīng)鉗夾損傷后RGCs的保護(hù)作用目的:探討尾靜脈和損傷部位注射hADSCs對(duì)RGCs的保護(hù)作用。方法:SD大鼠120只,重量為220g-250g,隨機(jī)將其分為5組,分別為單純損傷組,損傷部位干細(xì)胞組,損傷部位凍存液組,尾靜脈干細(xì)胞組,尾靜脈凍存液組,每組各24只。模型制作成功后,單純損傷組不做任何處理,損傷部位干細(xì)胞組立即于損傷部位視神經(jīng)鞘內(nèi)注射hADSCs,損傷部位凍存液組立即于損傷部位視神經(jīng)鞘內(nèi)注射凍存液,尾靜脈干細(xì)胞組立即于尾靜脈注射hADSCs,尾靜脈凍存液組即于尾靜脈注射凍存液。治療完成后,分別在3天、7天、14天、28天,取材行HE染色和TUJ-1免疫熒光染色,行RGCs計(jì)數(shù),比較5組之間的差異。結(jié)果:1、傷后第3天,尾靜脈干細(xì)胞組、單純損傷組、損傷部位干細(xì)胞組之間RGCs數(shù)量差異不明顯,無顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);第7天和第14天,尾靜脈干細(xì)胞組比單純損傷組和損傷部位干細(xì)胞組RGCs下降速度減慢,并且有顯著差異(P0.05),單純損傷組和損傷部位干細(xì)胞組之間無差異(P0.05);第28天,尾靜脈干細(xì)胞組、單純損傷組、損傷部位干細(xì)胞組之間差異均不明顯,無顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。2、尾靜脈凍存液組、損傷部位凍存液組和單純損傷組之間,在各個(gè)時(shí)間節(jié)點(diǎn)上RGCs計(jì)數(shù)均無明顯差異(P0.05)。結(jié)論:尾靜脈注射hADSCs可減緩視網(wǎng)膜節(jié)細(xì)胞的下降速度,對(duì)RGCs具有一定的保護(hù)作用,但是這種保護(hù)作用持續(xù)時(shí)間較為短暫。三、hADSCs對(duì)大鼠視神經(jīng)鉗夾損傷后視神經(jīng)軸突再生的影響目的:探討hADSCs對(duì)視神經(jīng)和視網(wǎng)膜GAP-43、GFAP表達(dá)的影響以及對(duì)軸突運(yùn)輸?shù)淖饔谩７椒?選擇SD大鼠120只,重量為220g-250g,隨機(jī)將其分為5組,分別為單純損傷組,損傷部位干細(xì)胞組,損傷部位凍存液組,尾靜脈干細(xì)胞組,尾靜脈凍存液組,每組各24只。處理方法同第二部分。治療完成后,分別在3天、7天、14天、28天,取材行視神經(jīng)、眼球免疫熒光染色(GAP43、GFAP),測(cè)定視神經(jīng)、眼球組織的IOD值和GAP43陽性視神經(jīng)纖維通過損傷部位的數(shù)量;另選擇SD大鼠30只,處理方法相同,利用Western Blot方法在第14天測(cè)定各組視網(wǎng)膜GAP43蛋白含量。另選擇SD大鼠30只,處理方法相同,利用羅丹明B在傷后第14天行順行視路示蹤,測(cè)定視神經(jīng)纖維再生長度;結(jié)果:1、尾靜脈干細(xì)胞組:視神經(jīng)GAP43在損傷后第3天開始表達(dá)增加,第7天達(dá)到高峰,第14天開始下降,第28天明顯下降;與單純損傷組相比,熒光IOD值在第3天、第28天無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05),在第7天、第14天有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。視網(wǎng)膜GAP43的熒光IOD值與也存在類似的改變,與單純損傷組相比,IOD值在第3天、第28天無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05),在第7天、第14天有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。視神經(jīng)GFAP在第3天開始增加,到第7天左右達(dá)到高峰,第28天明顯下降,與單純損傷組相比,在各個(gè)時(shí)間節(jié)點(diǎn)上均無顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05);視網(wǎng)膜GFAP免疫熒光強(qiáng)度在第3天開始增加,到第14天左右達(dá)到高峰,第28天有所下降,與單純損傷組相比第3天無顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05),在第7天、第14天、第28天均有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。2、損傷部位干細(xì)胞組:視神經(jīng)GAP43在損傷后第3天開始表達(dá)增加,第7天達(dá)到高峰,第14天開始下降,第28天明顯下降;與單純損傷組相比,熒光IOD值在第3天、第28天無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05),在第7天、第14天有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。視網(wǎng)膜GAP43的熒光IOD值與單純損傷組相比,熒光IOD值在第3天、第28天無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05),在第7天、第14天有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。視神經(jīng)GFAP與單純損傷組熒光IOD值變化一致,在各個(gè)時(shí)間節(jié)點(diǎn)上均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05);視網(wǎng)膜GFAP免疫熒光強(qiáng)度在第3天開始增加,第14天明顯增加,第28天達(dá)到高峰,與單純損傷組相比第3天無顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05),在第7天、第14天、第28天均存在顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。3、損傷部位凍存液組和尾靜脈凍存液組視神經(jīng)GAP43和GFAP變化規(guī)律與單純損傷組一致,在各個(gè)時(shí)間節(jié)點(diǎn)上均無明顯差異(P0.05);視網(wǎng)膜GAP43和GFAP變化規(guī)律與單純損傷組一致,在各個(gè)時(shí)間節(jié)點(diǎn)上也均無明顯差異(P0.05)。4、Western Blot檢測(cè)結(jié)果顯示:損傷后第14天各組GAP43蛋白表達(dá)以尾靜脈干細(xì)胞組和損傷部位干細(xì)胞組較高,其蛋白表達(dá)水平的相對(duì)灰度值均比單純損傷組高,有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05),其中尾靜脈干細(xì)胞組蛋白表達(dá)最高,與免疫熒光測(cè)定結(jié)果相同。損傷部位干細(xì)胞組、損傷部位凍存液組和尾靜脈凍存液組蛋白表達(dá)水平的相對(duì)灰度值與單純損傷組相比均無明顯差異(P0.05)。5、GAP43陽性視神經(jīng)再生纖維通過損傷部位數(shù)目:傷后第14天,尾靜脈干細(xì)胞組和損傷部位干細(xì)胞組GAP43陽性視神經(jīng)再生纖維通過損傷部位的纖維數(shù)目比單純損傷組多,有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05),尾靜脈干細(xì)胞組比損傷部位干細(xì)胞組數(shù)量多(P0.05)。損傷部位凍存液組和尾靜脈凍存液組與單純損傷組無明顯差異(P0.05)。6、羅丹明B順行視路示蹤:傷后第14天,尾靜脈干細(xì)胞組和損傷部位干細(xì)胞組示蹤劑通過損傷部位后運(yùn)行的最大距離均比單純損傷組長,存在顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05),尾靜脈干細(xì)胞組比損傷部位干細(xì)胞組運(yùn)行的最大距離更長(P0.05)。損傷部位凍存液組和尾靜脈凍存液組與單純損傷組無明顯差異(P0.05)。結(jié)論:hADSCs對(duì)視神經(jīng)損傷后的纖維再生具有促進(jìn)作用,有利于視神經(jīng)軸突的再生、改善軸突運(yùn)輸功能。四、hADSCs對(duì)視神經(jīng)鉗夾損傷大鼠的毒性及免疫學(xué)試驗(yàn)?zāi)康?明確hADSCs對(duì)大鼠全身毒性以及免疫相關(guān)因子的影響。方法:模型制作和各組處理方法均同第二部分,治療完成后,分別在3天、7天、14天、28天處死大鼠,采用心臟取血,分別加入EDTA抗凝真空管、生化標(biāo)本管和枸櫞酸鈉抗凝管內(nèi)保存,生化標(biāo)本管不采用抗凝劑,取血完成后離心、分離血清,-80℃冰箱保存?zhèn)溆?待標(biāo)本收集完成后,統(tǒng)一測(cè)定,血常規(guī)和凝血功能即時(shí)送檢測(cè)定。檢測(cè)血常規(guī)、電解質(zhì)、肝腎功能、凝血功能并采用IFN-γ、IL-4酶聯(lián)免疫試劑盒檢測(cè)大鼠血清IFN-γ、IL-4水平,比較各項(xiàng)指標(biāo)五組之間的差異。結(jié)果:單純損傷組、尾靜脈干細(xì)胞組、損傷部位凍存液組、損傷部位干細(xì)胞組以及尾靜脈凍存液組相比,大鼠血常規(guī)、肝腎功能、電解質(zhì)、凝血功能、血清IFN-γ、IL-4水平均無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。
【關(guān)鍵詞】：視神經(jīng)損傷 人源性脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞 臨床前研究
【學(xué)位授予單位】：第二軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R651.15
【目錄】：

• 摘要6-11
• Abstract11-19
• 中英文縮略語對(duì)照表19-20
• 前言20-24
• 第一部分 大鼠視神經(jīng)鉗夾損傷動(dòng)物模型的建立和評(píng)價(jià)24-37
• 材料與方法24-29
• 結(jié)果29-35
• 討論35-36
• 結(jié)論36-37
• 第二部分 hADSCs對(duì)大鼠視神經(jīng)鉗夾損傷后RGCs的保護(hù)作用37-44
• 材料與方法37-38
• 結(jié)果38-42
• 討論42-43
• 結(jié)論43-44
• 第三部分 hADSCs對(duì)大鼠視神經(jīng)鉗夾損傷后視神經(jīng)軸突再生的影響44-64
• 材料與方法44-47
• 結(jié)果47-62
• 討論62-63
• 結(jié)論63-64
• 第四部分 hADSCs對(duì)視神經(jīng)鉗夾損傷大鼠的毒性及免疫學(xué)試驗(yàn)64-76
• 材料與方法64-66
• 結(jié)果66-74
• 討論74-75
• 結(jié)論75-76
• 全文總結(jié)76-77
• 參考文獻(xiàn)77-82
• 綜述 外傷性視神經(jīng)病變最新治療進(jìn)展82-89
• 參考文獻(xiàn)87-89
• 碩士期間參加科研工作情況89-90
• 致謝90

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前5條

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本文編號(hào)：565632