本文關(guān)鍵詞：新型β-磷酸三鈣復(fù)合物修復(fù)SD大鼠顱骨缺損的實驗研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：研究意義人體的骨骼系統(tǒng)具有維持運動、保護(hù)體內(nèi)臟器、支撐體重等重要功能,創(chuàng)傷、感染、腫瘤、骨髓炎手術(shù)清創(chuàng)以及各種先天性疾病是導(dǎo)致骨缺損的主要原因。保守估計,美國每年消耗數(shù)千億美元用于治療各種原因?qū)е碌墓侨睋p。我國每年也有眾多患者需要進(jìn)行骨移植手術(shù),消耗驚人。目前自體骨移植、異體骨移植和人工合成骨填充是臨床常見的骨組織替代修復(fù)方法,自體骨移植是目前臨床最常用的治療方法,也同時被認(rèn)為是治療骨缺損的金標(biāo)準(zhǔn),自體骨移植具有其他兩種替代材料無法比擬的優(yōu)點,如無排斥反應(yīng)、無污染、材料成本低、可完全吸收、有效誘導(dǎo)骨重建；而異體骨來源則較自體骨豐富,免疫源性低,可提供結(jié)構(gòu)支撐等優(yōu)點。但這些治療方法仍存在很多不足,自體骨移植供骨量少、需要額外的取骨手術(shù)部位而相應(yīng)地增加了麻醉及手術(shù)的時間、并發(fā)癥相對較高、取骨部位長時間疼痛不適等；異體骨存在來源問題,可能導(dǎo)致疾病傳染,免疫排斥反應(yīng),人工合成骨填充材料目前仍舊只能起到骨缺損填充及支持作用,不能有效地誘導(dǎo)自體骨生長。常用的人工骨有磷酸鈣骨水泥及丙烯酸酯類骨水泥,但二者在組織相容性、機械強度、骨傳導(dǎo)性方面的平衡仍無法完全滿足臨床需要,因此,如何更好的修復(fù)骨組織缺損,一直是修復(fù)重建研究領(lǐng)域的熱點之一。近年來,關(guān)于生物材料的研究,新型骨移植材料、骨生物工程學(xué)的研究與應(yīng)用,逐漸成為骨科領(lǐng)域的熱點研究問題之一。材料支架是骨組織工程生物材料的核心元素,各種支架可根據(jù)骨缺損形態(tài)需要成型,作為連接細(xì)胞和組織的框架,引導(dǎo)組織生長成特定形態(tài),同時起到機械支撐作用,抵抗外來的壓力,為細(xì)胞提供繁殖分化和新陳代謝的場所。隨著材料工藝的不斷進(jìn)步,支架材料的研究也日趨豐富。目前研究較多的支架材料有磷酸鈣骨水泥(CPC)、磷酸三鈣復(fù)合物(TCP)、聚已內(nèi)酯(PCL)、聚乳酸-羥基乙酸共聚物(PLGA)等,各種支架材料都在成骨等方面有著不同的表現(xiàn)。體外構(gòu)建與天然骨成分、結(jié)構(gòu)相似的骨生物替代材料,被認(rèn)為是解決目前各種骨組織填充材料不足的有效方法之一。磷酸三鈣(TCP)則是人體骨骼常見成分,生物材料中最常用的是p-磷酸三鈣(p-TCP),其具有良好的生物相容性、生物活性以及生物降解性,是理想的人體硬組織修復(fù)和替代材料。目前β-TCP已廣泛應(yīng)用于骨科、口腔科的組織修復(fù)中。目前相關(guān)骨組織工程基礎(chǔ)研究,已形成了比較豐富的聯(lián)合種子細(xì)胞、生物活性因子及生物材料支架構(gòu)建生物功能化骨生物材料的理論和技術(shù)方法。間充質(zhì)干細(xì)胞(MSC)是屬于中胚層的一類多能干細(xì)胞,主要存在于結(jié)締組織和器官間質(zhì)中,體內(nèi)含量最高的是骨髓組織,骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSC)是目前研究最多的干細(xì)胞之一,因其具有良好的多向分化能力,獲取較為簡便等優(yōu)點,是目前干細(xì)胞研究中的熱點。BMSC作為種子細(xì)胞,目前研究已廣泛開展至心臟、肝臟、骨、軟骨等組織細(xì)胞和器官損傷中。相關(guān)研究表明,不同來源的干細(xì)胞由于自身差異可能表現(xiàn)出對于同一種材料的不同反應(yīng),而不同來源的干細(xì)胞在成骨方面也有不同的效果。既往認(rèn)為“支架”、“種子細(xì)胞”、“活性因子”是骨組織修復(fù)材料不可或缺的三要素,但是隨著生物材料研究的不斷深入,使得關(guān)于細(xì)胞因子的研究逐漸豐富,種子細(xì)胞的重要性逐漸弱化,細(xì)胞因子在生物材料研究中占據(jù)越來越重要的角色。不同的復(fù)合活性因子的材料在研究中有著不同程度的促進(jìn)成骨、成血管的優(yōu)勢,無需額外添加細(xì)胞的復(fù)合因子-支架材料則為生物材料的研究提供了新的思路。其中較為常用的細(xì)胞因子包括骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)及血小板衍生生長因子(PDGF),BMP-2是轉(zhuǎn)化生長因子-β(transforming growth factor-β, TGF-β)超家族一類的多功能生長因子,其具有促進(jìn)成骨及促進(jìn)成骨細(xì)胞分化的功能,并表達(dá)特異性的成骨細(xì)胞產(chǎn)物。而PDGF-BB是人體內(nèi)重要的促有絲分裂因子之一,能促進(jìn)成骨細(xì)胞的生長,骨折局部由于機械損傷產(chǎn)生大量PDGF,促使骨原細(xì)胞轉(zhuǎn)化為成骨細(xì)胞,從而促進(jìn)骨折的愈合。不同的細(xì)胞因子對骨生物材料的成骨成血管效果的影響尚存在爭議。因此,加強骨生物材料的基礎(chǔ)研究,構(gòu)建載細(xì)胞活性因子的新型生物功能化骨生物材料,觀察其在體內(nèi)骨組織修復(fù)中的作用效果,同時了解其在體內(nèi)的降解速度、骨傳導(dǎo)及骨誘導(dǎo)性能,不僅對提高骨生物材料的認(rèn)識具有相當(dāng)?shù)目茖W(xué)意義,也可為臨床骨缺損的治療提供全新的治療思路和技術(shù)方法。研究目的本研究所使用的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞來源于SD大鼠,分離后進(jìn)行體外培養(yǎng)擴增,與β-TCP材料支架共培養(yǎng)并成骨誘導(dǎo)分化,觀察材料對SD大鼠BMSCs增殖及成骨分化的影響。此外,β-TCP搭載BMP-2/PDGF-BB構(gòu)建組織工程骨修復(fù)SD大鼠顱骨標(biāo)準(zhǔn)骨缺損,觀察β-磷酸三鈣復(fù)合材料在骨組織再生修復(fù)應(yīng)用的效果,為骨生物材料的基礎(chǔ)研究,成骨及成血管提供實驗資料和科學(xué)依據(jù)。研究方法1.SD大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在β-磷酸三鈣復(fù)合材料中的增殖及成骨分化材料使用新型β-TCP復(fù)合物(CaPfromGEM21),材料預(yù)制成直徑3.6mm,厚度1.5mm的圓盤形支架,采取雙側(cè)股骨、脛骨骨髓,用密度梯度離心法分離并擴增BMSCs,第三代BMSCs做流式細(xì)胞學(xué)檢測表面標(biāo)記物,后將第三代BMSCs與β-TCP支架于24孔培養(yǎng)板共培養(yǎng),每個β-TCP支架種植細(xì)胞數(shù)3*105個,添加成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)液(含100nM地塞米松,10mMβ-磷酸甘油,0.05mM抗壞血酸和10nnM維生素D3)對BMSCs進(jìn)行成骨誘導(dǎo)分化21天,對照組采用同樣方法將BMSCs 種植于材料,使用普通培養(yǎng)液培養(yǎng)。第1、4、7、14、21天根據(jù)實驗計劃需要進(jìn)行電鏡掃描,Live/Dead染色法對細(xì)胞生長活性進(jìn)行檢測,觀察成骨組及對照組BMSCs增殖。pNpp定量法對堿性磷酸酶(ALP)活性進(jìn)行檢測,通過實時逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(qRT-PCR)測定其骨鈣素(OC)I型骨膠原(Co1-I),堿性磷酸酶(ALP)及RunX-2成骨基因的表達(dá)結(jié)果。茜素紅染色法對在材料支架進(jìn)行染色并定量成骨過程形成的礦化物,觀察BMSCs在材料支架上的成骨誘導(dǎo)分化。2.載骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2/血小板衍生生長因子-BB的β.磷酸三鈣復(fù)合材料用于修復(fù)SD大鼠顱骨標(biāo)準(zhǔn)骨缺損的實驗研究材料使用復(fù)合了骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2(Bone Morphogenetic Protein,BMP-2)或血小板衍生生長因子-BB(Platelet Derived Growth Factor-BB,PDGF-BB)的β-磷酸三鈣材料Calcium Phosphate from Growth-factor Enhanced Matrix 21 (CaPfromGEM21),每組材料搭載BMP-2/PDGF-BB中的一種,BMP-2(濃度為10mg/100ng)/PDGF-BB(濃度為0.3ug/3ug),另設(shè)置單純材料組、空白組各1組,共6組實驗組：(1)CaPfromGEM21；(2)CaPfromGEM21+10ng BMP-2; (3)CaPfromGEM21+100ng BMP-2；(4)CaPfromGEM21+0.3ug PDGF-BB; (5)CaPfromGEM21+3ug PDGF-BB；(6)空白組。實驗動物為健康的SPF級3月齡雄性Sprague-Dawley大鼠,3%戊巴比妥鈉腹腔灌注麻醉動物,用環(huán)鉆于頂骨兩側(cè)制作兩個直徑為3.6mm的全層圓形骨缺損,兩側(cè)缺損隨機植入兩組不同的實驗材料,術(shù)后6周處死動物并取出標(biāo)本進(jìn)行檢測,標(biāo)本檢測方法包括：X線、Micro CT,蘇木素-伊紅染色(HE染色)及相關(guān)的定量分析。研究結(jié)果體外擴增可見大鼠間充質(zhì)干細(xì)胞生長旺盛,呈長梭形、旋渦狀或麥浪狀細(xì)胞集落成,流式細(xì)胞學(xué)檢測提示采集的細(xì)胞符合骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞表面標(biāo)記特點。大體觀察可見間充質(zhì)干細(xì)胞在支架上生長增殖活躍,電鏡掃描圖片可以觀察到BMSCs在β-TCP支架表面貼附生長,細(xì)胞伸展形態(tài)自然,表現(xiàn)出良好的生長活力。Live/Dead染色提示細(xì)胞在支架上增殖活躍,活細(xì)胞百分?jǐn)?shù)定量結(jié)果提示對照組與成骨組之間在1/4/7/14天各時間點的活細(xì)胞百分比之間均無統(tǒng)計學(xué)差異；視野活細(xì)胞數(shù)定量結(jié)果提示隨培養(yǎng)時間延長,組內(nèi)活細(xì)胞數(shù)逐漸增加,成骨組第7/14天每視野活細(xì)胞數(shù)均明顯大于第1/4天,兩組間比較,同一時間點間均無統(tǒng)計學(xué)差異。ALP活性測定提示成骨組ALP活性逐步升高,而對照組則沒有明顯升高趨勢。成骨組第14/21天結(jié)果顯著大于其他時間點結(jié)果,具有統(tǒng)計學(xué)意義。qRT-PCR結(jié)果提示成骨組各成骨基因在不同時間點達(dá)到峰值,成骨組ALP基因表達(dá)第四天達(dá)峰值,約為第1天5倍。COL-Ⅰ及OC基因表達(dá)峰值均出現(xiàn)在第7天,均為第1天表達(dá)量6倍,而RunX-2基因峰值出現(xiàn)在第14天,為第1天表達(dá)量約3倍。對照組各時間點成骨基因表達(dá)量則無明顯峰值出現(xiàn)。茜素紅染色可見隨培養(yǎng)時間延長,材料表面的礦物染色逐漸加深,定量分析提示成骨組第21天礦化定量顯著高于成骨組第14天及第7天,兩組間同一時間點均有統(tǒng)計學(xué)差異。動物手術(shù)過程無動物出現(xiàn)麻醉死亡,術(shù)后無動物出現(xiàn)感染。X線影像提示各組骨缺損均有不同程度的修復(fù),骨折線逐漸模糊,PDGF-BB組的骨缺損基本修復(fù)。Micro CT可見各組骨缺損均有不同程度新生骨長入,新生骨體積定量結(jié)果提示添加PDGF-BB組新生骨體積明顯高于BMP-2實驗組,具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。HE染色切片各組均未見急慢性炎癥細(xì)胞浸潤,缺損中可見染色均一的新生骨組織,新生骨內(nèi)及周圍可見散在的新生血管及其中的紅細(xì)胞,新生骨面積百分?jǐn)?shù)提示lOng BMP-2組及0.3ug PDGF-BB組新生骨量百分?jǐn)?shù)均明顯大于單純材料組(P0.05),新生血管密度定量提示4個添加因子的實驗組的新生血管密度均明顯大于空白組及單純材料組(P0.05),4個添加因子的實驗組之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。結(jié)論新型p-磷酸三鈣復(fù)合物材料細(xì)胞毒性小,生物相容性好,骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞可在其表面成活生長,并保持良好旺盛的增殖及理想的成骨誘導(dǎo)效果。復(fù)合BMP-2/PDGF-BB后材料保持良好的生物相容性,骨缺損修復(fù)效果優(yōu)于單純材料植入,有望成為理想的新型骨再生修復(fù)替代材料之一。
【關(guān)鍵詞】：β-磷酸三鈣 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞 成骨誘導(dǎo) BMP-2/PDGF-BB 顱骨缺損
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R318.08;R651.1
【目錄】：

• 摘要3-9
• ABSTRACT9-18
• 前言18-23
• 第一部分 SD大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在新型B-磷酸三鈣復(fù)合材料中的增殖及成骨分化23-44
• 1.1 引言23
• 1.2 材料23-26
• 1.3 方法26-32
• 1.4 結(jié)果32-40
• 1.5 討論40-43
• 1.6 結(jié)論43-44
• 第二部分 載骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2/血小板衍生生長因子-BB/B-磷酸三鈣復(fù)合物用于修復(fù)SD大鼠顱骨骨缺損的實驗研究44-59
• 2.1 引言44-45
• 2.2 材料45-47
• 2.3 方法47-49
• 2.4 結(jié)果49-55
• 2.5 討論55-58
• 2.6 結(jié)論58-59
• 參考文獻(xiàn)59-72
• 縮略詞表72-73
• 攻讀碩士期間成果73-74
• 致謝74-76

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