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新型可注射、可降解、抗骨質(zhì)疏松多功能骨水泥的體內(nèi)外研究

發(fā)布時(shí)間:2017-06-12 18:03

  本文關(guān)鍵詞:新型可注射、可降解、抗骨質(zhì)疏松多功能骨水泥的體內(nèi)外研究,由筆耕文化傳播整理發(fā)布。


【摘要】:背景骨質(zhì)疏松性骨折常發(fā)生胸腰椎椎體、老年髖部或橈骨遠(yuǎn)端骨質(zhì)等,骨質(zhì)疏松性骨折的風(fēng)險(xiǎn)跟年齡有很大的相關(guān)性,所以中國社會(huì)骨質(zhì)疏松相關(guān)性骨折的患病率將隨我國日益加重的老年化而變得越來越嚴(yán)重。辛伐他汀(simvastatin,SIM)不僅具有調(diào)脂作用,文獻(xiàn)報(bào)道還具有抗骨質(zhì)疏松作用,但其抗骨質(zhì)疏松效益還沒充分挖掘出來,口服SIM需經(jīng)肝腎代謝,患者長期服用不方便依從性差,而且到達(dá)骨組織的藥物較少,不能達(dá)到藥物最低有效濃度,因此,找尋一種合適的藥物載體,改變骨科相關(guān)疾病的單一給藥方式,成為了目前國內(nèi)外學(xué)者研究的一個(gè)熱點(diǎn)。磷酸鈣骨水泥(calcium phosphate cement,CPC)因其自固化、可降解、不產(chǎn)熱、具有骨傳導(dǎo)性及良好的組織相容性等優(yōu)點(diǎn)被用于骨質(zhì)疏松性椎體壓縮骨折的治療,然而其降解速度慢及無抗骨質(zhì)疏松作用限制了其臨床應(yīng)用。通過聚左旋乳酸(Poly-L-lactic acid,PLLA)制作載藥微球后與CPC混合,能更好的控制藥物的緩釋,實(shí)現(xiàn)SIM的靶向緩釋治療,能大大提高SIM的生物利用率,增強(qiáng)CPC在骨質(zhì)疏松性骨折的功效,在骨質(zhì)疏松性脊柱壓縮性骨折中實(shí)現(xiàn)材料降解與骨生成率匹配及抗骨質(zhì)疏松功效,實(shí)現(xiàn)骨質(zhì)疏松椎體壓縮性骨折的生理性愈合,拓寬了CPC材料的應(yīng)用途徑。本實(shí)驗(yàn)對(duì)SIM-PLLA-CPC多功能骨水泥進(jìn)行材料學(xué)研究細(xì)胞學(xué)研究及兔骨質(zhì)疏松模型在體實(shí)驗(yàn),在體動(dòng)物實(shí)驗(yàn)抗骨質(zhì)疏松分析,為進(jìn)一步的臨床研究提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)支持,為臨床應(yīng)用打下基礎(chǔ)。目的通過將SIM-PLLA載藥微球與CPC混合,優(yōu)化最佳材料復(fù)合比,構(gòu)建一種新型SIM-PLLA-CPC多功能骨水泥材料,并通過材料學(xué)研究、細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)及動(dòng)物在體實(shí)驗(yàn)等方面對(duì)多功能骨水泥材料進(jìn)行評(píng)估,為骨質(zhì)疏松椎體壓縮骨折的臨床治療提供又一選擇。方法1、SIM-PLLA微球的制備:通過快速膜乳化法制備微球;2、多功能骨水泥的制備:分別制備含載藥PLLA微球質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0%、5%和10%磷酸鈣骨水泥粉末:分別為對(duì)照組(單純CPC組)、SIM-PLLA-CPC(?)劑量組及SIM-PLLA-CPC高劑量組,用物理共混的方法載藥SIM-PLLA微球與CPC固相粉劑混合,對(duì)照組不加入載藥微球,獲得多功能骨水泥粉劑;3、通過SEM觀察SIM-PLLA微球的表征;4、SIM-PLLA微球的包封率及載藥率測量:取微球溶解進(jìn)行紫外測量,計(jì)算微球中的藥物質(zhì)量。計(jì)算包封率和載藥率。5、復(fù)合骨水泥的理化性質(zhì):測定材料的可注射性、凝固時(shí)間、力學(xué)強(qiáng)度、X線衍射分析及體外降解率。6、SIM-PLLA微球體外藥物釋放規(guī)律檢測稱量微球到透析袋放入PBS溶液中,在37℃下釋放;觀察藥物釋放情況。7、多功能骨水泥細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn):把剛出生的SD大鼠取顱骨用組織塊培養(yǎng)法培養(yǎng)成骨細(xì)胞,接種于材料試樣表面共培養(yǎng)一定時(shí)間后,進(jìn)行電鏡觀察細(xì)胞在材料表面的粘附情況,用CCK8方法檢測復(fù)合材料對(duì)成骨細(xì)胞粘附及增殖的影響,應(yīng)用ALP試劑盒檢測材料對(duì)成骨細(xì)胞分化的影響。8、骨質(zhì)疏松模型的構(gòu)建按張X等的方法建立兔骨質(zhì)疏松模型,即去勢+地塞米松處理的方法。9、動(dòng)物分組及動(dòng)物在體實(shí)驗(yàn):將造模成功的新西蘭大耳白兔,隨機(jī)分為3組,即CPC組,SIM-PLLA-CPC低劑量組和SIM-PLLA-CPC高劑量組。取兔子股骨髁外側(cè)切口,用電鉆開出圓柱狀骨缺損,植入骨水泥材料。10、Micro-CT分析:在術(shù)后4、12周兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)每組分別隨機(jī)處死6只兔子,把股骨遠(yuǎn)端分離,Micro-CT掃描,通過分析軟件得出標(biāo)本中剩余材料的體積比(RMVF)和新骨長入的體積分?jǐn)?shù)(BVF)以及材料周圍骨小梁的立體測量學(xué)指標(biāo),如骨小梁的厚度、數(shù)量及密度等。結(jié)果1、SEM下可見微球均勻球狀結(jié)構(gòu),分散性好,微球間無黏連。粒徑大小均勻,表面較多褶皺。2、SIM-PLLA微球的包封率及載藥率測量:計(jì)算得到SIM-PLLA微球的載藥率是9.3%,包封率是36.1%。3、體外復(fù)合材料理化性質(zhì)測定:3.1、可注射性能、凝固時(shí)間及力學(xué)強(qiáng)度檢測:注射性:前4min時(shí),單純CPC組和含PLLA微球組的注射性能無明顯差異,8min后,含PLLA微球組可注射性均大于單純CPC組比較,注射性有所改善,未見復(fù)合骨水泥材料出現(xiàn)固液分離現(xiàn)象,三組材料間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),而含微球組高低劑量組間的比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。凝固時(shí)間:CPC組和兩個(gè)含PLLA微球組比較,微球組凝固時(shí)間延長,但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。力學(xué)強(qiáng)度:可見,各材料組力學(xué)強(qiáng)度在1d、7d時(shí)間點(diǎn),各組間比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。3.2 X射線衍射分析(XRD):單純CPC組和SIM-PLLA-CPC組樣品的XRD譜線與標(biāo)準(zhǔn)羥基磷灰石譜線相同,兩組材料XRD主峰位于30°附近,沒有發(fā)現(xiàn)其它衍射峰。3.3、復(fù)合SIM-PLLA骨水泥材料表征SEM結(jié)果見復(fù)合材料表面較為致密,在放大1000倍條件下,局部可見70~80μm大小的孔徑,表面可見較多結(jié)晶體,可見部分微球分布,在5000倍放大條件下,可見較多褶皺微球嵌入材料里面,均勻的在材料間分布,微球結(jié)構(gòu)保持完整視野中微球粒徑大小在1~3μn左右。4、藥物釋放檢測:由圖3可見,藥物緩釋觀察時(shí)間周期25天,SIM-PLLA微球在前5天時(shí)間里有明顯的突釋現(xiàn)象,第10天后,釋放率達(dá)51.25±4.35%,10天以后SIM-PLLA微球藥物緩釋平穩(wěn),直到25天時(shí)達(dá)到69.75±4.79%。5、CPC和SIM-PLLA-CPC材料表面成骨細(xì)胞黏附實(shí)驗(yàn)在培養(yǎng)4h后,各組的粘附性均無差異(P0.05),隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長,低、高劑量SIM-PLLA-CPC組細(xì)胞的黏附性提高,并與單純CPC比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異P0.05,高劑量SIM-PLLA-CPC組OD值比低劑量組高,但其差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義P0.05,細(xì)胞在材料表面培養(yǎng)12h后,低、高劑量SIM-PLLA-CPC組黏附性指標(biāo)更高,與單純CPC材料比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異P0.05。6、CPC和SIM-PLLA-CPC材料表面成骨細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn):在1、3、5、7天時(shí)CCK-8方法所測得的吸光度值,在第1天時(shí),低、高劑量SIM-PLLA-CPC組比單純CPC組OD值更高,但只有高劑量組與單純CPC組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異P0.05,培養(yǎng)的第3天,兩組SIM-PLLA-CPC均比CPC高且有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,OD值隨SIM-PLLA-CPC微球含量的增高而增高,說明載藥微球?qū)?xì)胞無毒副作用,生物相容性好,并表現(xiàn)出與SIM劑量相關(guān)的活性。7、CPC和SIM-PLLA-CPC材料表面成骨細(xì)胞分化實(shí)驗(yàn):單純CPC和低、高劑量SIM-PLLA-CPC材料表面接種細(xì)胞后7天檢測ALP活性結(jié)果,可見含高劑量SIM組ALP活性比單純CPC和低劑量組高,其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義P0.05,低劑量SIM-PLLA-CPC酶活性比單純CPC的高,但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異P0.05。8、Micro-CT分析結(jié)果:單純CPC組RMVF從4w的91.6±0.13%到12w的84.32±2.03,而高劑量材料組從4w的84.5±0.73%到12w時(shí)的75.6±2.11%,說明高劑量組材料的降解速度明顯快于單純CPC組(P0.05),而低劑量組材料降解速度介于單純CPC和高劑量組之間(P0.05),說明不同劑量載藥微球?qū)Σ牧辖到馑俣扔袆┝肯嚓P(guān)性。新骨長入的體積分?jǐn)?shù)(BVF),各組材料均有隨時(shí)間推移,新骨生成率增加的趨勢,其中高劑量SIM-PLLA-CPC組新骨生成速度最快,在12w時(shí)達(dá)到了17.8±1.49%,遠(yuǎn)大于單純CPC的9.72±0.75%(P0.05)。而低劑量組材料中新骨生長速度介于單純CPC和高劑量組之間(P0.05),并且低劑量組和高劑量組間比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05),說明不同劑量載藥微球?qū)Σ牧洗龠M(jìn)骨生長速度有劑量相關(guān)性。Micro-CT三維重建圖及截面重建圖:可見三組材料均出現(xiàn)隨4w、12w時(shí)間推移材料進(jìn)一步降解,新生骨逐漸長入的情況。單純CPC組材料三維重建及橫截面4w與12w的影像圖無明顯改變,低劑量SIM-PLLA-CPC組12w的材料與4w比較,材料隨時(shí)間推移降解明顯,4w時(shí)可見新生骨呈星點(diǎn)狀生長,12w時(shí)復(fù)合材料進(jìn)一步降解,材料降解出來的空間有新骨長入內(nèi)部。高劑量組與低劑量組材料比較,上述隨時(shí)間變化的趨勢更加明顯,三維重建可見材料12w時(shí)已經(jīng)呈疏松多孔結(jié)構(gòu),可見高劑量組材料周邊與骨組織切合緊密,新生成的骨組織由周邊往材料深面生長,新骨長入范圍也更廣。植入材料術(shù)后4w時(shí)材料周圍的骨小梁參數(shù),可以看出各組差異不顯著P0.05,僅僅高劑量SIM-PLLA-CPC組骨小梁數(shù)量1.95±0.18 mm-1,高于其它兩組P0.05;表X2顯示12周時(shí)情況,12w時(shí)高劑量組(BV/TV)、Tb.N、Tb.Sp均比單純CPC組有改善(P0.05),12w時(shí)CPC組各參數(shù)BV/TV、Tb.N還比4w時(shí)指標(biāo)下降了,但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。而高劑量組各指標(biāo)均比4w時(shí)有所改善。結(jié)論1)通過快速膜乳化法成制作載藥微球SIM-PLLA,粒徑大小為(1.63±0.54)μm,表面褶皺,球型飽滿。2)復(fù)合SIM-PLLA微球的SIM-PLLA-CPC材料表面較為緊密,SIM-PLLA微球均勻分布在材料內(nèi)部,XRD反映材料結(jié)晶仍主要為羥基磷灰石,表面SIM-PLLA微球?qū)ψ怨袒^程無明顯干擾,復(fù)合材料在注射性能、凝固時(shí)間、力學(xué)性能等方面無明顯差異;3)體外緩釋方面,藥物緩釋觀察時(shí)間周期25天,SIM-PLLA微球在前5天時(shí)間里有明顯的突釋現(xiàn)象,第10天后,釋放率達(dá)51.25±4.35%,10天以后SIM-PLLA微球藥物緩釋平穩(wěn),直到25天時(shí)達(dá)到69.75±4.79%。4)SIM-PLLA-CPC復(fù)合材料可促進(jìn)成骨細(xì)胞黏附、增殖及分化,有一定的劑量相關(guān)性,體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)也證實(shí)復(fù)合材料也有與單純CPC或PLLA材料相媲美的生物相容性,并且具有更強(qiáng)的促骨代謝作用。5)SIM-PLLA-CPC復(fù)合材料1個(gè)月的體外PH值變化穩(wěn)定,與單純CPC組比較無差異,說明PLLA與CPC復(fù)合可抑制PLLA降解產(chǎn)酸造成的PH值明顯降低效應(yīng)。6)SIM-PLLA-CPC復(fù)合材料在骨質(zhì)疏松兔股骨髁缺損部具有合適的力學(xué)強(qiáng)度、中后期更高的材料降解率及新骨生成率;7)SIM-PLLA-CPC復(fù)合材料在骨質(zhì)疏松兔模型中具有改善局部骨質(zhì)的效果,可實(shí)現(xiàn)即時(shí)力學(xué)支撐和局部抗骨質(zhì)疏松相結(jié)合;綜上所述,本實(shí)驗(yàn)通過將SIM-PLLA微球與CPC骨水泥復(fù)合構(gòu)建的SIM-PLLA-CPC復(fù)合骨水泥材料具有良好的生物相容性好、可注射性能及合適的力學(xué)強(qiáng)度,對(duì)兔骨質(zhì)疏松模型有明顯的成骨活性及抗骨質(zhì)疏松效果,有望成為治療骨質(zhì)疏松性椎體壓縮骨折的及不規(guī)則骨缺損的新型生物復(fù)合材料。
【關(guān)鍵詞】:骨質(zhì)疏松 磷酸鈣骨水泥 成骨細(xì)胞 Micro-CT 辛伐他汀
【學(xué)位授予單位】:南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】:碩士
【學(xué)位授予年份】:2016
【分類號(hào)】:R687
【目錄】:
  • 摘要3-9
  • ABSTRACT9-20
  • 前言20-33
  • 參考文獻(xiàn)27-33
  • 第一章 負(fù)載辛伐他汀微球的磷酸鈣骨水泥的構(gòu)建及性能檢測33-60
  • 1 材料與方法34-40
  • 2 結(jié)果40-50
  • 3 討論50-53
  • 4 結(jié)論53-55
  • 5 參考文獻(xiàn)55-60
  • 第二章 負(fù)載辛伐他汀微球的磷酸鈣骨水泥在體內(nèi)抗骨質(zhì)疏松研究60-73
  • 1 材料與方法60-62
  • 2 結(jié)果62-68
  • 3 討論68-70
  • 4 結(jié)論70
  • 5 參考文獻(xiàn)70-73
  • 全文小結(jié)73-74
  • 中英文對(duì)照縮略詞表74-75
  • 攻讀學(xué)位期間成果75-76
  • 致謝76-78

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4 王軍麗;PLLA基復(fù)合材料的結(jié)晶行為及力學(xué)性能研究[D];鄭州大學(xué);2015年

5 劉穎穎;熱致相分離法制備聚乳酸/聚己內(nèi)酯復(fù)合球晶及其性能表征[D];福建師范大學(xué);2015年

6 蘇張林;靜電紡絲聚乳酸/卵磷脂復(fù)合納米纖維膜的制備及性能的研究[D];華南理工大學(xué);2015年

7 郭有剛;PLLA/明膠納米纖維膜在不同模擬體液中生物礦化過程研究[D];北京化工大學(xué);2015年

8 張勝男;溫度梯度場中PLLA與PVDF結(jié)晶行為及橫晶結(jié)構(gòu)研究[D];大連理工大學(xué);2015年

9 趙宏偉;生物降解高分子聚左旋乳酸(PLLA)及聚(3-羥基丁酸酯-co-4-羥基丁酸酯)(P34HB)的改性研究[D];湘潭大學(xué);2015年

10 朱杰;生物可降解聚乳酸結(jié)晶行為的控制研究[D];東華理工大學(xué);2014年


  本文關(guān)鍵詞:新型可注射、可降解、抗骨質(zhì)疏松多功能骨水泥的體內(nèi)外研究,由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

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