關(guān)節(jié)軟骨的退變會(huì)給患者帶來(lái)嚴(yán)重的疼痛,會(huì)導(dǎo)致生活質(zhì)量下降和勞動(dòng)力喪失等,其對(duì)全球老齡人群的危害逐年上升。由于成年人關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞再生能力低下、數(shù)量有限,尋找新的功能性軟骨細(xì)胞來(lái)源成為關(guān)節(jié)軟骨再生的關(guān)鍵。利用容易獲取的成纖維細(xì)胞直接重編程（轉(zhuǎn)分化）為軟骨細(xì)胞,是一種快速、有效的再生手段。目前,已有科學(xué)家通過(guò)病毒過(guò)表達(dá)特定轉(zhuǎn)錄因子,成功誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞成軟骨細(xì)胞。然而,該方法不可避免的缺點(diǎn)包括:腫瘤生成、基因組突變、操作復(fù)雜等,為其臨床應(yīng)用帶來(lái)了風(fēng)險(xiǎn)。小分子藥物易于儲(chǔ)存、運(yùn)輸,且容易擴(kuò)散進(jìn)入細(xì)胞,不完全依賴于遞送載體。利用小分子藥物組合調(diào)控細(xì)胞命運(yùn),是一種方便、安全的方法,更具應(yīng)用前景。但是,利用小分子藥物誘導(dǎo)生成關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞的方法,目前尚待開(kāi)發(fā)。為解決軟骨細(xì)胞來(lái)源問(wèn)題,在本研究中,我們通過(guò)篩選小分子藥物組合的方法,建立成纖維細(xì)胞向軟骨細(xì)胞轉(zhuǎn)分化的誘導(dǎo)體系;利用三維培養(yǎng)技術(shù),誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞形成軟骨細(xì)胞團(tuán);利用高通量單細(xì)胞測(cè)序技術(shù),解析成纖維-軟骨細(xì)胞重編程多時(shí)間點(diǎn)的細(xì)胞表型動(dòng)態(tài)變化,探究這一復(fù)雜過(guò)程的分子機(jī)制;通過(guò)體內(nèi)關(guān)節(jié)軟骨修復(fù)模型,驗(yàn)證化學(xué)誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞的體內(nèi)再生功能。我們的發(fā)現(xiàn)包括:1)組... 

【文章來(lái)源】：浙江大學(xué)浙江省 211工程院校 985工程院校 教育部直屬院校

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【學(xué)位級(jí)別】：博士

【部分圖文】：

圖0總體研究路線

基于小分子藥物篩選建立成纖維-軟骨細(xì)胞重編程系統(tǒng)

浙江大學(xué)博士學(xué)位論文第一章組合式篩選建立成纖維-軟骨細(xì)胞重編程體系23使用方差分析計(jì)算整體差異，并結(jié)合Tukey檢驗(yàn)計(jì)算兩兩差異或Dunnett檢驗(yàn)計(jì)算和對(duì)照組間的差異；對(duì)于不符合正態(tài)分布或非連續(xù)變量多組之間數(shù)據(jù)的比較，使用Kruskal-Wallis檢驗(yàn)計(jì)算整體差異，配合Dunns檢驗(yàn)兩兩差異。所有數(shù)據(jù)表示平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤。*P<0.05;**P<0.01;***P<0.001。1.4實(shí)驗(yàn)結(jié)果1.4.1成纖維-軟骨細(xì)胞化學(xué)重編程基本模型的建立為建立化學(xué)重編程誘導(dǎo)體系，我們根據(jù)已有文獻(xiàn)中的模型[48]，使用分步誘導(dǎo)的方法，轉(zhuǎn)分化小鼠胚胎成纖維細(xì)胞（mouseembryonicfibroblast,MEF）為軟骨細(xì)胞（如圖1-2）。在第一階段，即培養(yǎng)的第0-6天，我們利用三種常用轉(zhuǎn)分化小分子化合物組合VCR（VPA、CHIR-98014和Repsox）及5%低濃度氧[48]處理成纖維細(xì)胞；在第二階段，即培養(yǎng)的第7天起，更換培養(yǎng)基，利用軟骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基進(jìn)行成軟骨誘導(dǎo)。在誘導(dǎo)的終末階段，即培養(yǎng)的第20天，用番紅O-固綠染色的方式鑒定誘導(dǎo)結(jié)果。圖1-2成纖維-軟骨細(xì)胞重編程“兩步法”誘導(dǎo)方案示意圖Stage1,2：第一、二階段；Day-2,0,20：開(kāi)始誘導(dǎo)前2天、誘導(dǎo)第0天、第20天；Cellexpansion：細(xì)胞擴(kuò)增；CocktailVCR&Hypoxia：VCR組合和低氧誘導(dǎo)；ChondrogenicMedium：成軟骨培養(yǎng)基；MEFs：小鼠胚胎成纖維細(xì)胞；SafraninOStaining：番紅O染色。番紅O-固綠染色可以區(qū)分軟骨的細(xì)胞外基質(zhì)和纖維/骨組織的胞外基質(zhì)[91]。用成纖維細(xì)胞和小鼠間充質(zhì)干細(xì)胞分別進(jìn)行軟骨分化誘導(dǎo)后，番紅O-固綠染色


本文編號(hào)：3554308