發(fā)布時(shí)間：2021-11-24 22:06

　　目的:前期實(shí)驗(yàn)證實(shí)晚期糖基化終產(chǎn)物（AGE）隨年齡增加在椎間盤內(nèi)累積是椎間盤退變的重要危險(xiǎn)因素,其可以促進(jìn)髓核細(xì)胞凋亡,加速細(xì)胞外基質(zhì)代謝失衡。但其中確切分子機(jī)制尚未完全明確,本實(shí)驗(yàn)旨在進(jìn)一步探究AGEs與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、凋亡、鈣穩(wěn)態(tài)之間的關(guān)系。方法:用不同濃度AGEs（PBS,AGEs 100μg/ml,AGEs 200μg/ml）處理人髓核細(xì)胞,或使用鈣通道拮抗劑U73122,xestospongin C和Ryanodine預(yù)處理后。分別于0 h,12h,24 h三個(gè)時(shí)間點(diǎn)檢測(cè)。分別用鈣離子特異性探針Fluo 4/AM/Mag-Fluo 4/AM檢測(cè)胞質(zhì)內(nèi)鈣濃度/內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)鈣濃度,蛋白免疫印跡Western blot和實(shí)時(shí)定量熒光PCR檢測(cè)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜鈣泵SERCA和鈣通道IP3R和RyR的蛋白和轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平,ELISA檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)IP3表達(dá)水平,AnnexinV-APC/7-AAD染色流式檢測(cè)髓核細(xì)胞凋亡率。結(jié)果:AGEs可以引起濃度依賴性和時(shí)間依賴性胞質(zhì)鈣超載和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣耗竭,同時(shí)伴有鈣泵SERCA蛋白和轉(zhuǎn)錄水平減低,鈣通道IP3R和RyR蛋白和轉(zhuǎn)錄水平增高,細(xì)胞內(nèi)IP3表達(dá)水平增高;使用鈣... 

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【部分圖文】：

AGEs誘導(dǎo)人髓核細(xì)胞內(nèi)游離鈣分布轉(zhuǎn)位

22圖 2AGEs 誘導(dǎo)人髓核細(xì)胞內(nèi)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣泵及鈣通道異常表達(dá)。使用濃度 AGEs（100μg/ml、200 μg/ml）處理人髓核細(xì)胞不同時(shí)間（0 h，12 h，24 h），PBS 作為陰性對(duì)照。（A）Western Blot及相對(duì)定量分析檢測(cè)IP3R、RyR和SERCA的蛋白表達(dá)水平，GAPDH作為內(nèi)參。（B）qPCR 檢測(cè) IP3R、RyR 和 SERCA 的 mRNA 表達(dá)水平，GAPDH 作為內(nèi)參。（C）ELISA 法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi) IP3 表達(dá)水平。（D）超微量定磷法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)肌漿網(wǎng)酶 SERCA 的活性變化。數(shù)據(jù)采用均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，*p < 0.05 vs.對(duì)應(yīng) PBS 對(duì)照組，*p < 0.05 vs. 0 h 組。

華 中 科 技 大 學(xué) 碩 士 學(xué) 位 論 文3.3 鈣通道拮抗劑對(duì) AGEs 介導(dǎo)的髓核細(xì)胞鈣穩(wěn)態(tài)失衡的影響隨后，為了進(jìn)一步探究鈣通道在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣穩(wěn)態(tài)失衡中的關(guān)鍵作用，我們使用鈣通道的拮抗劑 U73122，Xec 和 Rya，分別抑制 PLC 活性，減少 PIP2 水解生成 IP3，從而抑制 IP3 途徑，和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣離子 IP3R 和 RyR 通道。先用鈣通道拮抗劑分別處理人髓核細(xì)胞后，再用 AGEs 200 μg/ml 處理 24 h。如圖 3A、3B 流式分析結(jié)果顯示，單獨(dú)鈣通道拮抗劑 U73122、Xec 和 Rya 處理，對(duì)髓核細(xì)報(bào)胞質(zhì)鈣和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣濃度無(wú)明顯影響，同時(shí)，鈣通道拮抗劑預(yù)處理組與單獨(dú) AGEs 處理組相比，可明顯緩解胞質(zhì)鈣超載和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)耗竭（p<0.05）。上述結(jié)果說(shuō)明，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣通道功能異常在 AGEs 介導(dǎo)的髓核細(xì)胞內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)失衡中具有重要作用，鈣通道拮抗劑可部分緩解細(xì)胞內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)失衡。


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