[目的]既往對瘢痕疙瘩發(fā)病機制的研究,主要致力于成纖維細(xì)胞、細(xì)胞外基質(zhì)等,現(xiàn)越來越多的證據(jù)證明角質(zhì)形成細(xì)胞也積極參與瘢痕疙瘩的發(fā)生發(fā)展,而其在瘢痕疙瘩病理過程中的作用有待深入探索。本研究構(gòu)建高表達(dá)Smad7的瘢痕疙瘩角質(zhì)形成細(xì)胞（Keloidkeratinocyte,KK）,檢測KK的功能變化情況,探索Smad7蛋白以及KK與瘢痕疙瘩形成的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化和TGF-β信號通路之間的關(guān)系,為研發(fā)瘢痕疙瘩對應(yīng)治療的新策略和新方法提供科學(xué)依據(jù)。[方法]取一名男性患者肩胛部瘢痕疙瘩（經(jīng)患者同意）,手術(shù)切除的組織作為實驗標(biāo)本來源,在無菌條件下采用細(xì)胞培養(yǎng)法體外培養(yǎng)KK。體外構(gòu)建高表達(dá)Smad7的慢病毒,并以對應(yīng)空載體制作慢病毒。使用感染增強劑Polybrene構(gòu)建細(xì)胞株,并按照細(xì)胞株分組為:KK組（正常分離培養(yǎng)的瘢痕疙瘩角質(zhì)形成細(xì)胞）、GFP組（空載體慢病毒感染組）和mSmad7組（高表達(dá)Smad7慢病毒感染組）,通過QPCR定量檢測Smad7 mRNA表達(dá)水平和Western Blotting檢測Smad7蛋白表達(dá)水平評估感染效率。以高效感染和表達(dá)Smad7為基礎(chǔ):流式細(xì)胞儀檢測周期變化情況,C... 

【文章來源】：昆明醫(yī)科大學(xué)云南省

【文章頁數(shù)】：55 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【部分圖文】：

圖１分離細(xì)胞的瘢痕疙瘩組織圖??

，轉(zhuǎn)移置含ＰＢＳ的??１５ｍｌ離心管中，８００ｒ／ｍｉｎ離心５ｍｉｎ??②棄上清，加入新鮮的培養(yǎng)基吹打混勻后轉(zhuǎn)移置細(xì)胞培養(yǎng)瓶中??③置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)??２．２?Ｓｍａｄ７基因過表達(dá)載體構(gòu)建和慢病毒包裝??２．２．１?Ｓｍａｄ７表達(dá)載體構(gòu)建??（１）酶切位點分析：通過美國國家生物技術(shù)信息中心（ｈｔｔＰｓ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．??ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）查詢到基因號為ＮＭ—００５９０４．３的序列，序列通過ｐｒｉｍｅｒ?ｐｒｉｍｅｒ５??軟件和結(jié)合ｐＬＶ－ＥＧＦＰ－２Ａ載體（如圖２）酶切位點選擇ＥｃｏＲＩ和ＢａｍＨＩ。??ＰＬＶ－ＥＧＦＰ－２Ａ?Ｃａｔ．?Ｎｏ．?ＶＬ３４０１??５＿?ＬＴＲ??Ａｍｐ（Ｒ）?【?７、，，Ｐｓｉ??／ＲＲＥ??ｐＵＣ．?ｏｒｉｇｉｎ?￡■／??置?ｃＰＰＴ／ＣＴＳ??ｐＬＶ－ＥＧＦＰ－２Ａ?＾??８９０４?ｂｐ??ＣＭＶ?Ｐｒｏｍｏｔｅ??？ＬＴＲ＾＼，?Ｍ??＼／?ＥＧＦＰ??Ｖ－ｆＲｔ?…．?ＭＣ５??Ｐｏｒｏ（Ｒ）／?ＰＧＫ?Ｐｒｏｍｏｔｅｒ??圖２?ｐＬＶ－ＥＧＦＰ－２Ａ載體結(jié)構(gòu)??１３??

裝成每支８０ｕｌ，取其中的一支加入１５ｘ蛋白上樣緩沖液２（Ｖ丨，于沸水浴中煮５ｍｉｎ，??－８０°Ｃ保存。??（２）用ＢＣＡ蛋白定量試劑盒測定樣品中蛋白含量：按照碧云天提供的試劑??盒提供酶標(biāo)儀測定樣品在５６２ｎｍ處的吸光值將ＢＳＡ標(biāo)準(zhǔn)品在５６２ｎｍ處經(jīng)過空白??校正的平均吸光值對其濃度（Ｈｇ／ｍＬ）作圖，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖３。ｙ＝２．１５２＊Ｘ??＋０．１９５９，Ｙ：吸光值，Ｘ：濃度（呢／ｍＬ）；?Ｒ２＝０．９９７。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出樣??品的蛋白濃度（圖３）。??１．５－１??Ｙ?＝?２．１５２＊Ｘ?＋０．１９５９?＆??Ｒ２＝０．９９７?＾??｜?１０??！?０?５??１?＞??０．０－１?１?１?１??０．０?０．２?０．４?０．６??ＢＳＡ?Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ?（ｕｇ／ｕｉ）??圖３蛋白濃度測定標(biāo)準(zhǔn)曲線??（３）制膠：根據(jù)下面表格按順序制備分離膠和濃縮膠，先制備分離膠，并用異??丙醇液封閉，３０ｍｉｎ后棄去異丙醇，用蒸餾水洗１０次，用紙吸干水。濃縮膠配??好后ｌＯｍｉｎ即可開始使用。??分離膠制備如下表９：??１０％膠（１０ｍｌ）蒸餾水?３０％Ａｃｒ－Ｂｉｓ?ｌＭＴｒｉｓ?１０％Ｓ?１０％?過硫酸?ＴＥＭ??（２９：１）?ＰＨ８．８?ＤＳ?銨?ＥＤ??體積（ｍｌ）?２．７?３．３?３．８?０．１?０．１?０．００４??２０??


本文編號：3409072