目的:建立大鼠終板軟骨細胞體外張力誘導(dǎo)退變模型,探討Wnt信號通路與Ecadherin/β-catenin復(fù)合體偶聯(lián)在張力誘導(dǎo)終板軟骨細胞退變中的作用機制。方法:無菌條件下分離大鼠腰椎終板軟骨,酶消化法提取終板軟骨細胞,選擇二代終板軟骨細胞,采用FX-5000細胞應(yīng)變加載系統(tǒng)建立體外終板軟骨細胞張力載荷模型;采用特異性抑制劑調(diào)控wnt/β-catenin信號通路;通過基因轉(zhuǎn)染過表達E-cadherin基因。Realtime RT-PCR及Western blot檢測加力前后軟骨軟骨標(biāo)志基因Ⅱ型膠原、蛋白多糖、Sox9、β-catenin、E-cadherin等基因及蛋白的表達變化;甲苯胺藍染色及阿辛藍染色觀察加力前后軟骨細胞的表型;分別采用AlamarBlue、流式細胞術(shù)及鬼筆環(huán)肽染色檢測終板軟骨細胞增殖、凋亡及細胞骨架的變化;免疫熒光檢測β-catenin及E-cadherin在終板軟骨細胞胞中的定位;通過核質(zhì)分離實驗檢測β-catenin蛋白在終板軟骨細胞質(zhì)及細胞核中的表達;采用免疫共沉淀實驗檢測E-cadherin與β-catenin蛋白之間的相互作用。結(jié)果:張力加載后終板軟骨細... 

【文章來源】：皖南醫(yī)學(xué)院安徽省

【文章頁數(shù)】：65 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【部分圖文】：

圖1張力載荷下終板軟骨細胞細胞軟骨標(biāo)志基因的表達及軟骨表型的改變：A：RealtimeRT-PCR檢測張力加載前后終板軟骨細胞中二型膠原（COL-2A）、蛋白聚糖(ACAN)及Sox9的表

張力刺激對終板軟骨細胞增殖、凋亡及細胞骨架的影響。A：Alamar Blue 試驗檢測張荷下終板軟骨細胞增殖的變化；B：ANEXIN V- PI 染色、流式細胞術(shù)分析張力加載前后終骨細胞凋亡的變化。C：鬼筆環(huán)肽染色、激光共聚焦顯微鏡下觀察終板軟骨細胞骨架（F-）的變化，紅色為 F-actin,藍色為細胞核。Ctrl:對照組 ICMT：加力組 （n ≥ 3，* P5）所有試驗均重復(fù) 3 次以上。re 2：ICMT did not influence the cells apoptosis of end plate chondrocytes but altered celiferation and cytoskeleton.End plate chondrocytes were treated with 10% ICMT in vitro for 3. A：Cells proliferation was examined by Alamar Blue test B: Cells apoptosis was examinedI-ANEXIN V fluorescence in FACS analysis. C: Immunostaining of F-actin showed thge of chondrocytes cytoskeleton after 3 days’ ICMT treatment, red for F-actin and blue foI. Control (Ctrl) means no-loading, ICMT means mechanical tension application. Data werented as mean ± SD (n ≥ 3;* P < 0.05). All experiments were repeated at least three times.

結(jié)果發(fā)現(xiàn)張力加載后 TCF1 及 CyclinD1 基因的表達明顯增高（詳見圖3E）。上述結(jié)果表明，張力刺激能夠明顯激活終板軟骨細胞中 Wnt/β-catenin 信號通路，Wnt/β-catenin信號通路的激活可能與張力誘導(dǎo)終板軟骨細胞退變相關(guān)。

【參考文獻】：
期刊論文
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[3]Sox9基因在終板軟骨細胞退變模型中的表達變化及意義[J]. 徐宏光,賴必華,陳學(xué)武,靳松,王弘,劉平,王凌挺,黃德剛,畢富勇.  中華醫(yī)學(xué)雜志. 2008 (37)



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