目的:建立大鼠終板軟骨細(xì)胞體外張力誘導(dǎo)退變模型,探討Wnt信號(hào)通路與Ecadherin/β-catenin復(fù)合體偶聯(lián)在張力誘導(dǎo)終板軟骨細(xì)胞退變中的作用機(jī)制。方法:無菌條件下分離大鼠腰椎終板軟骨,酶消化法提取終板軟骨細(xì)胞,選擇二代終板軟骨細(xì)胞,采用FX-5000細(xì)胞應(yīng)變加載系統(tǒng)建立體外終板軟骨細(xì)胞張力載荷模型;采用特異性抑制劑調(diào)控wnt/β-catenin信號(hào)通路;通過基因轉(zhuǎn)染過表達(dá)E-cadherin基因。Realtime RT-PCR及Western blot檢測(cè)加力前后軟骨軟骨標(biāo)志基因Ⅱ型膠原、蛋白多糖、Sox9、β-catenin、E-cadherin等基因及蛋白的表達(dá)變化;甲苯胺藍(lán)染色及阿辛藍(lán)染色觀察加力前后軟骨細(xì)胞的表型;分別采用AlamarBlue、流式細(xì)胞術(shù)及鬼筆環(huán)肽染色檢測(cè)終板軟骨細(xì)胞增殖、凋亡及細(xì)胞骨架的變化;免疫熒光檢測(cè)β-catenin及E-cadherin在終板軟骨細(xì)胞胞中的定位;通過核質(zhì)分離實(shí)驗(yàn)檢測(cè)β-catenin蛋白在終板軟骨細(xì)胞質(zhì)及細(xì)胞核中的表達(dá);采用免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)檢測(cè)E-cadherin與β-catenin蛋白之間的相互作用。結(jié)果:張力加載后終板軟骨細(xì)... 

【文章來源】：皖南醫(yī)學(xué)院安徽省

【文章頁(yè)數(shù)】：65 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【部分圖文】：

圖1張力載荷下終板軟骨細(xì)胞細(xì)胞軟骨標(biāo)志基因的表達(dá)及軟骨表型的改變：A：RealtimeRT-PCR檢測(cè)張力加載前后終板軟骨細(xì)胞中二型膠原（COL-2A）、蛋白聚糖(ACAN)及Sox9的表

張力刺激對(duì)終板軟骨細(xì)胞增殖、凋亡及細(xì)胞骨架的影響。A：Alamar Blue 試驗(yàn)檢測(cè)張荷下終板軟骨細(xì)胞增殖的變化；B：ANEXIN V- PI 染色、流式細(xì)胞術(shù)分析張力加載前后終骨細(xì)胞凋亡的變化。C：鬼筆環(huán)肽染色、激光共聚焦顯微鏡下觀察終板軟骨細(xì)胞骨架（F-）的變化，紅色為 F-actin,藍(lán)色為細(xì)胞核。Ctrl:對(duì)照組 ICMT：加力組 （n ≥ 3，* P5）所有試驗(yàn)均重復(fù) 3 次以上。re 2：ICMT did not influence the cells apoptosis of end plate chondrocytes but altered celiferation and cytoskeleton.End plate chondrocytes were treated with 10% ICMT in vitro for 3. A：Cells proliferation was examined by Alamar Blue test B: Cells apoptosis was examinedI-ANEXIN V fluorescence in FACS analysis. C: Immunostaining of F-actin showed thge of chondrocytes cytoskeleton after 3 days’ ICMT treatment, red for F-actin and blue foI. Control (Ctrl) means no-loading, ICMT means mechanical tension application. Data werented as mean ± SD (n ≥ 3;* P < 0.05). All experiments were repeated at least three times.

結(jié)果發(fā)現(xiàn)張力加載后 TCF1 及 CyclinD1 基因的表達(dá)明顯增高（詳見圖3E）。上述結(jié)果表明，張力刺激能夠明顯激活終板軟骨細(xì)胞中 Wnt/β-catenin 信號(hào)通路，Wnt/β-catenin信號(hào)通路的激活可能與張力誘導(dǎo)終板軟骨細(xì)胞退變相關(guān)。

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]兔椎體軟骨終板血管芽增齡性變化[J]. 徐宏光,陳小虎,王弘,王凌挺,陳學(xué)武.  中華骨科雜志. 2011 (04)
[2]Wnt signaling in disease and in development[J]. Roel NUSSE.  Cell Research. 2005(01)
[3]Sox9基因在終板軟骨細(xì)胞退變模型中的表達(dá)變化及意義[J]. 徐宏光,賴必華,陳學(xué)武,靳松,王弘,劉平,王凌挺,黃德剛,畢富勇.  中華醫(yī)學(xué)雜志. 2008 (37)



本文編號(hào)：3354369