目的:椎間盤(pán)退變（Intervertebral discdegeneration,IDD）是導(dǎo)致腰背痛的重要原因之一。相關(guān)研究表明,在IDD的病理性變化中活性氧分子增多,炎癥因子過(guò)表達(dá)及細(xì)胞外基質(zhì)丟失均是重要的誘因。阿司匹林（Aspirin）作為經(jīng)典的非甾體類消炎藥物之一,在臨床應(yīng)用中能夠有效緩解各類疼痛及炎癥。然而Aspirin能否通過(guò)減輕氧化應(yīng)激來(lái)改善IDD的進(jìn)程,目前并不清楚。本實(shí)驗(yàn)旨在研究Aspirin調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激對(duì)IDD的影響及作用機(jī)制,從而提出新的治療策略。方法:無(wú)菌條件下分離Sprague Dawley（SD）大鼠尾椎椎間盤(pán)髓核組織,進(jìn)行髓核細(xì)胞（Nucleus pulposus cells,NPCs）原代培養(yǎng)。應(yīng)用脂多糖（Lipopolysaccharide,LPS,1 μg/mL）誘導(dǎo)NPCs氧化應(yīng)激后,分別向培養(yǎng)基中加入Aspirin（5μg/mL或25μg/mL）。依次檢測(cè)活性氧（Reactive oxygen species,ROS）和炎癥因子的表達(dá)、并通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR、細(xì)胞免疫熒光染色技術(shù)來(lái)觀察髓核細(xì)胞的退變程度。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中,利用大鼠尾椎椎間盤(pán)穿刺模型誘... 

【文章來(lái)源】：蘇州大學(xué)江蘇省 211工程院校

【文章頁(yè)數(shù)】：86 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【部分圖文】：

圖１．１：?ＮＰＣｓ在倒置相差顯微鏡下形態(tài)??（Ａ）單個(gè)ＮＰＣｓ呈現(xiàn)梭形，（Ｂ）ＮＰＣｓ生長(zhǎng)密度約８０％時(shí)的光鏡形態(tài)

第一部分?Ａｓｐｉｒｉｎ調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激對(duì)椎間盤(pán)退變的影響及作用機(jī)制研究??胞增殖毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：隨時(shí)間（１、３、５ｄ）的增加，細(xì)胞增殖逐漸加快；與對(duì)照??組相比，ＬＰＳ濃度低于１０?ｐｇ／ｍＬ時(shí)不會(huì)對(duì)ＮＰＣｓ增殖產(chǎn)生不利影響；在１０?ｎｇ／ｍＬ或??１００?ｐｇ／ｍＬ濃度下ＮＰＣｓ，盡管增殖仍呈現(xiàn)隨時(shí)間延長(zhǎng)而増殖的趨勢(shì)，但與對(duì)照組相??比，增殖能力明顯受到抑制（圖１．２）。??—?—??圖１．１：?ＮＰＣｓ在倒置相差顯微鏡下形態(tài)??（Ａ）單個(gè)ＮＰＣｓ呈現(xiàn)梭形，（Ｂ）ＮＰＣｓ生長(zhǎng)密度約８０％時(shí)的光鏡形態(tài)。（比例尺：??４００?（ｉｍ）?〇??２?．５?１???—？?１?ＤＡＹ?３?ＤＡＹ?Ｋ３?５?ＤＡＹ??ｉｌｉｉｉｌｉｌｉｉｉｉｉｉ??ＬＰＳ?ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ?（ｐｇ／ｍＬ）??圖１．２：?ＣＣＫ８檢測(cè)ＬＰＳ對(duì)ＮＰＣｓ的增殖毒性??ＮＰＣｓ?與不同濃度?ＬＰＳ?（０、０．０１、０．１、１、１０、１００?｜＿ｉｇ／ｍＬ）共培養(yǎng)不同天數(shù)（１、??３、５ｄ）。當(dāng)ＬＰＳ濃度低于１０ｐｇ／ｍＬ對(duì)細(xì)胞增殖無(wú)影響。（＊Ｐ＜０．０５）。??２．?ＬＰＳ誘導(dǎo)ＮＰＣｓ氧化應(yīng)激??經(jīng)過(guò)上述實(shí)驗(yàn)，我們明確了使用ＬＰＳ的合理濃度范圍。實(shí)驗(yàn)中我們分別選擇不??同濃度ＬＰＳ?（０、０．０１、０．１、１昭／ｍＬ）處理ＮＰＣｓ，共兩塊２４孔板。在ＬＰＳ處理２４??ｈ后，應(yīng)用熒光探針標(biāo)記ＲＯＳ，第一塊２４孔板上的ＮＰＣｓ在倒置熒光顯微鏡下觀察??１２??

Ａｓｐｉｒｉｎ調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激對(duì)椎間盤(pán)退變的影響及作用機(jī)制研究?第一部分??可見(jiàn)：當(dāng)ＬＰＳ濃度增加時(shí)，所標(biāo)記的熒光強(qiáng)度及標(biāo)記的細(xì)胞數(shù)量均呈現(xiàn)遞增趨勢(shì)（圖??１．３?Ａ）。第二塊２４孔板上的ＮＰＣｓ通過(guò)流式儀進(jìn)行熒光強(qiáng)度量化分析，我們發(fā)現(xiàn)熒光??強(qiáng)度隨ＬＰＳ濃度增加而增加（圖１．３Ｂ）。隨后我們應(yīng)用ｌ＾ｇ／ｍＬ的ＬＰＳ選擇不同的時(shí)??間（０、０．２５、０．５、１、３、６、１２、２４?ｈ）來(lái)處理ＮＰＣｓ，并再次通過(guò)流式細(xì)胞儀觀察熒??光值來(lái)評(píng)估和量化氧化應(yīng)激強(qiáng)度。結(jié)果顯示：ＬＰＳ誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激呈現(xiàn)出明顯的時(shí)間??依賴性，并在１２ｈ時(shí)達(dá)到最大值（圖１．３Ｃ）。??接著我們通過(guò)Ｗｅｓｔｅｍ－ｂｌｏｔ實(shí)驗(yàn)觀察蛋白水平的表達(dá)情況，結(jié)果顯示．？相比對(duì)照??組，ＬＰＳ能夠有效誘導(dǎo)ＮＰＣｓ產(chǎn)生ｉＮＯＳ和ＣＯＸ２兩種氧化應(yīng)激相關(guān)蛋白，并減少保??護(hù)性蛋白?Ｎｕｃｌｅａｒ?ｆａｃｔｏｒ－ｅｒｙｔｈｒｏｉｄ?２－ｒｅｌａｔｅｄ?ｆａｃｔｏｒ?２?（Ｎｒｆ－２）的表達(dá)（圖?１．４?Ａ－Ｄ）。??Ｂ?Ｃ??Ｓ?Ｓ００！?ｆ?１０００－??？—?４５０－?Ｓ?．??ｇ?＊?？?８００－?ｊ??－ｉ?＿?卜??■?ＩＩ?Ｈａ??ｎｕ?ｍ?ｍ－ｍ?ｉ?：Ｕ＾ｉＵ??ｆ?＾?Ｋ?｜?０?、辦?Ａ?爺??ＬＰＳ?ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ?（ｐｇ／ｍＬ）?ＬＰＳ?ｃｕｌｔｕｒｅ?ｔｉｍｅ?（ｈｏｕｒ）??圖１．３：?ＬＰＳ誘導(dǎo)ＮＰＣｓ氧化應(yīng)激??（Ａ）倒置熒光顯微鏡下觀察不同濃度ＬＰＳ誘導(dǎo)ＮＰＣｓ氧化應(yīng)激。（Ｂ）流式細(xì)胞??１３??


本文編號(hào)：3353583