發(fā)布時(shí)間：2021-07-05 12:09

　　第一部分纖維環(huán)YAP蛋白區(qū)域性表達(dá)與膠原纖維直徑和彈性模量的關(guān)系[摘要]目的:探討纖維環(huán)沿徑向不同區(qū)域的YAP蛋白表達(dá)及其與膠原纖維拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)以及彈性模量的關(guān)系。方法:獲取新西蘭白兔的纖維環(huán)組織,原子力顯微鏡觀察纖維環(huán)內(nèi)、中、外三區(qū)膠原纖維直徑大小,納米壓痕測(cè)試檢測(cè)各區(qū)纖維環(huán)微觀力學(xué)特性,免疫組化、免疫熒光以及Western Blot法檢測(cè)各區(qū)細(xì)胞YAP和磷酸化YAP的表達(dá)情況。RT-qPCR檢測(cè)纖維環(huán)各區(qū)細(xì)胞表型標(biāo)志基因表達(dá)情況。結(jié)果:原子力顯微鏡掃描顯示,纖維環(huán)膠原纖維呈定向排列,且內(nèi)區(qū)膠原纖維直徑較小,外區(qū)直徑較大,中區(qū)的直徑則介于內(nèi)外區(qū)之間;納米壓痕測(cè)試顯示由內(nèi)、中到外區(qū)纖維環(huán)組織彈性模量呈遞增趨勢(shì)。免疫組化、免疫熒光以及Western Blot結(jié)果表明由內(nèi)、中到外區(qū)YAP核轉(zhuǎn)錄水平逐漸增高,而磷酸化水平逐漸降低。PCR結(jié)果示Col-Ⅰ,Col5a1,Adamts17,Sfrp2,Col12a1在纖維環(huán)外區(qū)細(xì)胞中表達(dá)較高,而Col-Ⅱ和Aggrecan在纖維環(huán)內(nèi)區(qū)細(xì)胞中表達(dá)較高。結(jié)論:椎間盤纖維環(huán)YAP的表達(dá)、細(xì)胞表型標(biāo)志基因的表達(dá)、膠原纖維的直徑及彈性模量在沿徑向內(nèi)、中、外區(qū)域... 

【文章來(lái)源】：蘇州大學(xué)江蘇省

【文章頁(yè)數(shù)】：141 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：博士

【部分圖文】：

圖１．天然纖維環(huán)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)、力學(xué)特性和生化組成

ＹＡＰ在支架拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)和力學(xué)特性調(diào)控纖維環(huán)源干細(xì)胞分化中的作用?第一部分??毛發(fā)。于無(wú)菌條件下沿正中線切開皮膚、筋膜，緊貼著棘突的兩側(cè)切幵豎脊肌，咬除??橫突并顯露出Ｔ９－Ｌ５椎體，橫斷整個(gè)脊柱，剔除周圍的肌肉和軟組織，用１１號(hào)尖刀??片完整切取各節(jié)段椎間盤（圖１－１?Ａ－Ｂ）。??（２）纖維環(huán)的分區(qū)：將椎間盤移至超凈臺(tái)上，在連續(xù)變倍體視顯微鏡下使用顯??微外科剪去除髓核，同時(shí)去除纖維環(huán)組織周圍的肌肉、筋膜、軔帶組織以及碎骨片，??后將纖維環(huán)按照含水量多少分為內(nèi)、中、外三個(gè)區(qū)域（圖ＭＣ）。??ＰＩＨＨ??圖１－１椎間盤纖維環(huán)的分離及分區(qū)。Ａ：兔Ｔ９－Ｌ６脊柱椎體及其之間的椎間盤；Ｂ：切取的完??整椎間盤組織；Ｃ：分離髓核（１）與纖維環(huán)組織，將纖維環(huán)組織按含水量大小分為內(nèi)區(qū)（２）、中??區(qū)（３）以及外區(qū)（４）三區(qū)。??２．２兔纖維環(huán)組織的原子力顯微鏡掃描??２．２．１纖維環(huán)組織冰凍切片??（１）固定：獲得完整的椎間盤組織后，快速將其置入４％的多聚甲醛固定２４小??時(shí)：??（２）脫鈣：取出組織，蒸餾水沖洗３次后置入１４％的ＥＤＴＡ中脫鈣３天，每天??換一次液；??（３）脫水：１５％的蔗糖脫水６小時(shí)，后置入３０％的蔗糖過(guò)夜；??（４）包埋：將組織塊從蔗糖中取出迅速放置于塑料包埋盒內(nèi)（直徑約２?ｃｍ），??加適量ＯＣＴ包埋劑浸沒組織，然后將塑料包埋盒平放入盛有液氮的小杯內(nèi)，約１分??鐘組織迅速凝結(jié)成塊。如需要保存，則迅速以錫箔紙封包，置入－８０°Ｃ冰箱備用；??（５）切片：凍臺(tái)上均勻涂抹一層ＯＣＴ包埋劑，將速凍組織置于其上，放罝于速??凍架上１０分鐘。切片時(shí)溫度保持在－２０°Ｃ，將載有組織塊的凍臺(tái)固定在切片機(jī)上．在??

學(xué)分析，所有數(shù)據(jù)都用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（ｍｅａｎ±ＳＤ）??表示。其中蛋白表達(dá)分析、組織化學(xué)定量檢測(cè)、組織細(xì)胞數(shù)量統(tǒng)計(jì)和膠原纖維直徑分??析運(yùn)用單因素方差分析，納米壓痕測(cè)試使用多因素方差分析。對(duì)于單細(xì)胞統(tǒng)計(jì)，每個(gè)??視野至少選�。保皞�(gè)樣本進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。Ｖ＜０．０５為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。??二、結(jié)果??１．纖維環(huán)組織膠原纖維直徑檢測(cè)??原子力顯微鏡（ＡＦＭ）檢測(cè)內(nèi)、中、外三區(qū)兔纖維環(huán)組織膠原纖維直徑大校??通過(guò)ＡＦＭ掃描纖維環(huán)組織表面形貌可以清楚的觀察到膠原纖維直徑大小以及拓?fù)浣Y(jié)??構(gòu)（圖１－２Ａ）。統(tǒng)計(jì)結(jié)果得到纖維環(huán)三區(qū)的膠原纖維直徑分布圖（圖１－２Ｂ）。結(jié)果顯??示兔纖維環(huán)三區(qū)膠原纖維呈定向排列，纖維環(huán)內(nèi)區(qū)的膠原纖維平均直徑最小，為０．０７??［ｉｍ，外區(qū)膠原纖維平均直徑較大，為０．１８叫１，而中間區(qū)的膠原纖維平均直徑為０．１０??ｊｉｍ，介于內(nèi)區(qū)和外區(qū)之間。??Ａ?Ｂ??０１５１?０．０７?ｐｍ???ｉＡＦ??＿＿＿霞??ｃ－ｇ？?ＣＸ?３１０?０？?ＣＭ?＆１Ｃ?ＯＨ?Ｃ？?０Ｊ３?０３４??ｉＡＦ?ｍＡＦ?ｏＡＦ?Ｆｉｂｅｒ?ｄｉａｍｅｔｅｒ?（｜ｊｍ）??圖１－２纖維環(huán)內(nèi)、中、外三區(qū)的原子力顯微鏡掃描。Ａ：天然纖維環(huán)內(nèi)、中、外三區(qū)膠原纖??維ＡＦＭ掃描圖像；Ｂ：內(nèi)、中、外三區(qū)膠原纖維直徑分布統(tǒng)計(jì)圖。三組之間的直徑大小有統(tǒng)計(jì)學(xué)??意義（＊＞＜０．０５，ｎ＝２００）。??２．纖維環(huán)組織的力學(xué)測(cè)試??納米壓痕測(cè)試檢測(cè)兔纖維環(huán)內(nèi)、中、外三區(qū)微觀力學(xué)特征。通過(guò)５個(gè)不同頻率檢??測(cè)纖維環(huán)三區(qū)的儲(chǔ)存模量即彈性模量（表卜１），統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示纖維環(huán)內(nèi)區(qū)膠原纖維有??２５??

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]The effect of the fibre orientation of electrospun scaffolds on the matrix production of rabbit annulus fibrosus-derived stem cells[J]. Chen Liu,Caihong Zhu,Jun Li,Pinghui Zhou,Min Chen,Huilin Yang,Bin Li.  Bone Research. 2015(02)
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