發(fā)布時間：2021-06-20 12:48

　　第一部分Hippo信號通路介導(dǎo)椎間盤退變及髓核細(xì)胞老化目的探討Hippo信號通路介導(dǎo)椎間盤退變及髓核細(xì)胞老化的機(jī)制研究方法選取10周齡SD大鼠作為加速椎間盤退變（Intervertebral disc degeneration,IDD）模型對象,使用10%水合氯醛腹腔麻醉（0.3ml/100g）,定位尾椎椎間盤5-6,6-7,7-8,8-9共4個椎間盤,選用21G穿刺針,進(jìn)行加速IDD造模。術(shù)后4周（P4w組）和術(shù)后12周（P12w組）進(jìn)行影像學(xué)觀察。同時選取椎間盤自然退變組SD大鼠,分別是4周齡（4w組）、14周齡（14w組）、22周齡（22w組）、50周齡（50w組）,14w組和22w組分別是P4w組和P12w組的自然對照組。影像學(xué)（X射線和磁共振）和病理學(xué)檢測椎間盤退變,髓核組織基因和蛋白定量檢測Hippo信號通路關(guān)鍵分子。選取第三代髓核細(xì)胞（Nucleus pulposus cells,NPCs）（P3）進(jìn)行復(fù)制性老化誘導(dǎo),通過連續(xù)復(fù)制傳代（1:3傳代）培養(yǎng),一般傳至第10代（P10）即可出現(xiàn)老化表型。通過細(xì)胞形態(tài)觀察、生長曲線測定、細(xì)胞衰老β-半乳糖苷酶（Senescence... 

【文章來源】：東南大學(xué)江蘇省 211工程院校 985工程院校 教育部直屬院校

【文章頁數(shù)】：138 頁

【學(xué)位級別】：博士

【部分圖文】：

自然衰老組椎間盤退變（IDD）隨年齡增長逐漸發(fā)生

第一部分Hippo信號通路介導(dǎo)椎間盤退變及髓核細(xì)胞老化35的軟骨細(xì)胞樣細(xì)胞簇狀排列，我們可以看到AF和NP邊界斷裂，以及AF中纖維環(huán)排列紊亂，纖維環(huán)之間出現(xiàn)裂隙和斷裂（圖4G）。圖2：椎間盤自然退變與纖維環(huán)穿刺誘導(dǎo)退變HE病理學(xué)觀察（下一排是局部放大效果，黑色箭頭代表脊索樣髓核細(xì)胞）。2.4纖維環(huán)穿刺誘導(dǎo)椎間盤退變發(fā)生不完全自我修復(fù)為探討自然椎間盤退變組與穿刺組Hippo信號的差異，選取術(shù)后4w大鼠作為研究對象。令人驚訝的是，YAP在椎間盤的所有區(qū)域（NP，AF和CE）都上調(diào)，換句話說，Hippo信號通路被抑制（圖3A）。NP中的RealtimePCR和Westernblot也表明Hippo信號被抑制，YAP的表達(dá)增加，而p-YAP的表達(dá)減少（圖3B-C）。提取NP的全基因RealtimePCR和全蛋白Westernblot檢測目的基因YAP和和下游靶基因CTGF。顯示年齡越小，YAP和CTGF基因及蛋白的表達(dá)越高。在P4w組，YAP基因的表達(dá)與CTGF的表達(dá)趨勢一致，然而CTGF基因的表達(dá)與蛋白質(zhì)的表達(dá)趨勢不一致，我們推測椎間盤存在一定的自我修復(fù)能力和不完全自我修復(fù)（轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)）（圖3D和E）。為了研究纖維環(huán)穿刺損傷時間對YAP表達(dá)的影響，我們將觀察時間延長到穿刺后12w，并選擇22w大鼠作為對照。在本研究中，在P12w組，我們發(fā)現(xiàn)YAP在椎間盤中的表達(dá)下降（NP,AF和CE）（圖4G）。YAP和CTGF在基因和蛋白質(zhì)水平上是一致的且都下降（圖4H和J）。我們發(fā)現(xiàn)急性IDD時發(fā)現(xiàn)YAP表達(dá)增高，說明纖維環(huán)機(jī)械損傷條件下椎間盤自身具有一定的自我修復(fù)能力，而在慢性IDD中YAP被抑制。

東南大學(xué)博士學(xué)位論文36圖3：椎間盤自然退變組逐漸發(fā)生IDD，急性纖維環(huán)穿刺組快速誘導(dǎo)IDD并存在不完全自我修復(fù)代償。（A）定量聚合酶鏈反應(yīng)（RealtimePCR）比較4w、14w、P4w和50w組Hippo信號通路關(guān)鍵分子LATS1、LATS2、YAP和CTGF的相對表達(dá)；（B-E）蛋白質(zhì)印跡分析Hippo信號通路關(guān)鍵分子LATS1、LATS2、YAP、p-YAP和CTGF蛋白表達(dá)。柱狀圖顯示目的蛋白平均值相對內(nèi)參GAPDH表達(dá)量（C和E）（*P<0.05）。


本文編號：3239223