椎間盤退行性變（intervertebral disc degeneration,IVD）是引起慢性下腰痛（low back pain,LBP）最重要的原因之一,隨著醫(yī)學(xué)的不斷發(fā)展,人均壽命不斷延長,老齡化社會(huì)逐漸加劇,IVD的發(fā)病率亦呈逐年上升的趨勢,造成了嚴(yán)重的家庭和社會(huì)經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。目前IVD發(fā)生的具體機(jī)制尚存在爭議,因此針對其治療也尚缺乏有效的手段。近年來研究發(fā)現(xiàn),感染在椎間盤退變的病理過程中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用,且以痤瘡丙酸桿菌（Propionibacterium acnes,P.acnes）的研究最為廣泛。但P.acnes對人退變髓核細(xì)胞（nucleus pulposus cells,NPCs）焦亡的影響及其調(diào)控機(jī)制尚缺乏系統(tǒng)的研究。本課題擬從以下四個(gè)方面進(jìn)行闡述:1、人髓核組織、細(xì)胞的提取及痤瘡丙酸桿菌感染對髓核細(xì)胞炎癥因子分泌的影響;2、P.acnes誘導(dǎo)人髓核細(xì)胞焦亡的激活;3、MCC950通過TXNIP-NLRP3抑制炎癥減輕焦亡;4、MCC950對腰椎間盤內(nèi)P.acnes感染的影響。第一部分人髓核組織、細(xì)胞的提取及痤瘡丙酸桿菌感染對髓核細(xì)胞炎癥因子分泌的影響目的:探討... 

【文章來源】：重慶醫(yī)科大學(xué)重慶市

【文章頁數(shù)】：110 頁

【學(xué)位級(jí)別】：博士

【部分圖文】：

術(shù)中所取髓核組織標(biāo)本Fig1-1NPSpecimenHarvestDuringOperation

重慶醫(yī)科大學(xué)博士研究生學(xué)位論文31（2）NPCs培養(yǎng)約第10-11天后，40倍鏡下觀察細(xì)胞融呈團(tuán)簇狀分布，細(xì)胞融合度約50%（圖1-2b）；（3）NPCs培養(yǎng)約第14-15天后，鏡下(x40)可見細(xì)胞呈梭形緊密排列，細(xì)胞之間的間隙明顯變窄，細(xì)胞融合度約為80-90%（圖1-2c）。圖1-2髓核細(xì)胞融合度Fig1-2DegreeofNPCsFusion1.2.5初代髓核細(xì)胞傳代（1）將培養(yǎng)瓶（T25）內(nèi)融合度為80-90%的初代NPCs從孵箱內(nèi)取出，棄瓶內(nèi)培養(yǎng)基，加入PBS液“∞字法”快速潤洗后棄置，重復(fù)3次，洗盡殘余培養(yǎng)基（以加入培養(yǎng)瓶內(nèi)清洗后的PBS液清亮、透明為標(biāo)準(zhǔn)）；（2）胰酶消化液取1-2ml加入培養(yǎng)瓶內(nèi)，75%乙醇噴灑瓶身后放回細(xì)胞孵箱內(nèi)，靜置4min；（3）拍打瓶身促進(jìn)細(xì)胞脫落，顯微鏡下觀察細(xì)胞是否變圓、漂浮，隨后加入等體積完全培養(yǎng)基中和；（4）隨后把細(xì)胞懸液加入離心管離心（1000r/min，5min），棄上清；（5）加入2ml完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞；（6）各培養(yǎng)皿（10cm）中加入1ml細(xì)胞重懸液，隨后再加入5ml的完全培養(yǎng)基，傳代比例為1瓶傳2皿；（7）培養(yǎng)皿做好標(biāo)記，75%乙醇噴灑皿身后孵箱內(nèi)培養(yǎng)，每3天換液。

重慶醫(yī)科大學(xué)博士研究生學(xué)位論文35（6）電泳條件：電壓70V，待溴酚藍(lán)指示劑開始進(jìn)入分離膠后，調(diào)整電壓值110V，待指示劑接近凝膠底部時(shí)停止；（7）打開玻板，取出凝膠塊，根據(jù)Marker指示，準(zhǔn)備相應(yīng)寬度及長度的PVDF膜，并將PVDF膜放入無水乙醇內(nèi)活化10min，使其膜帶電荷；（8）將凝膠用卡片小心完整的轉(zhuǎn)移至電轉(zhuǎn)夾上，活化后的PVDF膜覆蓋在相應(yīng)位置后，封閉電轉(zhuǎn)夾；（9）凝膠、PVDF膜、電轉(zhuǎn)夾正負(fù)極順序示意圖如下（圖1-3）：圖1-3轉(zhuǎn)膜前安裝順序Fig1-3InstallationSequenceBeforeFilmTransfer（10）電轉(zhuǎn)條件：電轉(zhuǎn)夾正確放置后加入電轉(zhuǎn)液，然后將電轉(zhuǎn)槽放入冰盒，設(shè)置電流為250mA，時(shí)間110min；（11）取出PVDF膜，5%脫脂牛奶封閉，室溫?fù)u床上封閉2小時(shí)；（12）PVDF膜在封閉結(jié)束后用TBST液潤洗一次，放入對應(yīng)的一抗（IL-1β和IL-18，Abcam，1:1000）孵育盒中，4℃凍庫搖床上（70轉(zhuǎn)/min）孵育過夜；（13）將孵育過夜的PVDF膜取出，TBST液洗膜3次，15min/次；（14）將PVDF膜放入相應(yīng)的二抗，室溫?fù)u床上孵育2小時(shí)；（15）將PVDF膜再次用TBST液洗3次，15min/次；（16）ECL超敏顯影液顯影，采集保存圖片，ImageJ分析灰度值。

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]The Possibility and Molecular Mechanisms of Cell Pyroptosis After Cerebral Ischemia[J]. Zhaofei Dong,Kuang Pan,Jingrui Pan,Qingxia Peng,Yidong Wang.  Neuroscience Bulletin. 2018(06)



本文編號(hào)：3098576