研究背景修復(fù)外傷、疾病及先天畸形等原因?qū)е碌拇蠓秶浗M織缺損常常需要應(yīng)用組織填充物。目前,諸如真皮移植、人工合成材料及同種異體、異種組織來源填充物填充等多種方法均在臨床上采用。而自體脂肪移植因其良好的生物相容性、無免疫源性、獲取方便、價(jià)格便宜等特性,是理論上最佳的修復(fù)方式。然而因臨床醫(yī)生在脂肪組織的采集、處理和移植等方面的操作各不相同,有報(bào)道的脂肪移植后的體積吸收率從25%到80%不等,往往需要過度充填或是重復(fù)注射2-3次才能達(dá)到預(yù)期效果,再加上遠(yuǎn)期可能出現(xiàn)油囊形成、纖維鈣化等并發(fā)癥大大限制了其臨床應(yīng)用。因此,研究者們提出了許多被認(rèn)為能夠提高脂肪移植體積保留率的方法:包括以低壓抽吸、離心去水及立體多通道注射為核心的Coleman技術(shù),增加抽吸針口徑、低剪切力的采集技術(shù),離心或紗布過濾、洗滌過濾的脂肪處理技術(shù),移植受區(qū)微針、預(yù)擴(kuò)張等處理技術(shù),以及添加細(xì)胞成分、富血小板血漿(Platclet-rich plasma,PRP)以及各種生物活性因子等方法。通過盡可能地保留完整的脂肪結(jié)構(gòu),增加組織灌注,促進(jìn)血管新生等方式,以促進(jìn)移植物耐受血管重建前極端的缺血缺氧環(huán)境,減少組織壞死。然而由于缺乏高質(zhì)量的臨床及臨床前數(shù)據(jù)支持,它們的相對重要性難以評估,目前尚未有一種公認(rèn)最佳的解決方案能夠完全避免移植物的壞死。對脂肪移植后體積保留模式的持續(xù)深入研究表明,除了移植物直接存活下來以外,組織再生同樣在其中發(fā)揮重要作用。研究表明,脂肪組織的正常生理結(jié)構(gòu)主要由兩部分組成,即成熟脂肪細(xì)胞和位于脂肪細(xì)胞間隙內(nèi)的血管基質(zhì)片段(Stromal vascular fraction,SVF)。其中成熟脂肪細(xì)胞數(shù)量僅占不到7%,卻占據(jù)了組織中900%以上的體積,且具有高耗氧性。在脂肪移植后早期血液循環(huán)尚未建立時(shí),僅在移植物的最外層小于300微米的范圍內(nèi)成熟脂肪細(xì)胞能夠通過組織浸潤的方式存活下來,移植物中心大范圍成熟脂肪細(xì)胞均無法耐受缺血缺氧環(huán)境,出現(xiàn)壞死并釋放出大量的脂滴,隨之機(jī)體炎癥細(xì)胞逐漸浸潤移植物,包繞吞噬脂滴及細(xì)胞碎片,導(dǎo)致了移植物的體積吸收。最終小型的脂滴被清除,大型脂滴則會(huì)被包裹形成油囊、纖維鈣化。與此同時(shí),在移植物的外層,SVF細(xì)胞群中的脂肪來源干細(xì)胞(Adipose-derived stromal cells,ASCs),較脂肪細(xì)胞更能夠耐受缺血缺氧環(huán)境,可以通過分泌成血管相關(guān)生長因子,促進(jìn)新生血管由外向內(nèi)逐漸長入移植物,同時(shí)宿主來源的脂肪前體細(xì)胞及少數(shù)移植物中殘存的基質(zhì)干細(xì)胞隨著新生血管的長入逐漸遷入、定植、增殖并最終分化形成新生脂肪細(xì)胞,由外而內(nèi)實(shí)現(xiàn)局部的小葉狀脂肪再生。由此我們發(fā)現(xiàn):壞死的脂肪細(xì)胞是導(dǎo)致脂肪移植后體積保留率下降以及并發(fā)癥產(chǎn)生的主要原因。那么能否將脂肪移植后的“無效體積”——成熟脂肪細(xì)胞在移植之前提前分離去除呢?運(yùn)用傳統(tǒng)的膠原酶消化法、加入異丙醇等液體成分后離心的分離方法勢必會(huì)引入外源性材料,帶來了生物污染的風(fēng)險(xiǎn),更加難以作為常規(guī)臨床應(yīng)用。因此我們創(chuàng)新性地采用了使脂肪抽吸物快速通過較小口徑的管道系統(tǒng)的物理方法,利用剪切力選擇性破壞體積較大的成熟脂肪細(xì)胞,而不損傷體積較小的SVF細(xì)胞,繼而離心去除原有體積中超過90%的脂滴,在不添加任何外源性物質(zhì)的前提下,獲得了一種新型脂肪產(chǎn)物,我們將其命名為“SVF-gel”。SVF-gel高度濃縮了 ECM保護(hù)下的SVF細(xì)胞群,平均濃度可達(dá)原有水平的4.5倍,其中所含的ASCs更是達(dá)到原有的6.3倍,且其成骨、成軟骨、成脂分化能力未受損害。研究目的本研究將圍繞1、SVF-gel移植后能否長期保留,可否成功誘導(dǎo)體內(nèi)脂肪新生?2、誘導(dǎo)脂肪新生具體機(jī)制為何?3、脂肪新生的組織來源為何?三個(gè)問題進(jìn)行深入討論。首創(chuàng)性地對一種去除了成熟脂肪細(xì)胞的脂肪產(chǎn)物——SVF-gel,移植后組織學(xué)的動(dòng)態(tài)變化進(jìn)行探索,并通過比較SVF-gel與傳統(tǒng)脂肪移植在不同時(shí)間點(diǎn)的移植效果,觀察各時(shí)間點(diǎn)移植物體積保留率的變化、加之HE染色、馬松染色切片分析,免疫組化等技術(shù)來探討SVF-gel作為組織填充物移植后的效果、組織新生機(jī)制及其組織來源,為臨床實(shí)施高效容量填充提供方法指導(dǎo)及科學(xué)依據(jù)。材料與方法1、傳統(tǒng)游離脂肪及SVF-gel移植的模型制備及移植物存活的評價(jià)運(yùn)用注射器法獲取成年健康女性大腿及腹部皮下脂肪,其中一部分運(yùn)用Coleman技術(shù)制備為傳統(tǒng)脂肪移植組,另一部分通過以下步驟處理制備為SVF-gel:首先將脂肪抽吸物 1200 g/min 離心 3min 后,棄去底層液體,上層油脂回收備用,將中層脂肪組織裝入兩枚20ml注射器中,通過魯爾接頭密封對接,反復(fù)以10ml/s的速度推動(dòng)含有脂肪組織的注射器活塞,共推注1min。然后加入回收的油脂緩慢推注3～5次混勻,使用孔徑≤0.2mm的Nanotransfer進(jìn)行過濾后,堵住注射器出口,拉開針?biāo)ū３肿⑸淦鲀?nèi)負(fù)壓,輕微震蕩至注射器中出現(xiàn)絮凝現(xiàn)象。最后2000g/min離心3min,獲取中間層產(chǎn)物,即為SVF-g,el。使用1ml注射器連接注脂針,依照隨機(jī)化原則將兩組制備好的移植物分別注射在裸鼠兩側(cè)脅肋部皮下的2個(gè)受區(qū)。分別于注射后1天、3天、5天、7天、11天、15天、30天、60天和90天共9個(gè)時(shí)間點(diǎn),觀察移植物的大體情況;運(yùn)用排水法測量移植物體積,計(jì)算體積保留率;通過HE染色及馬松染色切片評估移植組織狀況。2、移植物中脂肪新生和血管新生的檢測分別于注射后1天、3天、5天、7天、11天、15天、30天、60天和90天共9個(gè)時(shí)間點(diǎn),檢測傳統(tǒng)脂肪移植組及SVF-gel移植組兩組內(nèi)HE染色、免疫組化染色(分別利用Isolectin、Perilipin抗體和Hoechst染色指示血管、脂肪細(xì)胞和有核細(xì)胞),通過系統(tǒng)軟件分析兩組間血管密度、脂肪壞死空泡區(qū)域面積及其變化趨勢,并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。3、移植物中炎癥水平的檢測于注射后1天、3天、5天、7天、11天、15天、30天、60天和90天進(jìn)行免疫組化染色(分別利用MAC2、CD206抗體和Hoechst染色指示巨噬細(xì)胞和有核細(xì)胞),通過系統(tǒng)軟件分析兩組間巨噬細(xì)胞數(shù)量和浸潤范圍,比較二者炎癥水平隨時(shí)間的變化趨勢。4、SVF-gel移植后脂肪新生的組織來源的檢測通過對移植后1天、3天、5天、7天、11天、15天、30天、60天和90天共9個(gè)時(shí)間點(diǎn)的SVF-gel進(jìn)行免疫組化染色(分別利用HLA抗體、Peril ipin抗體和Hoechst染色指示人來源的移植物細(xì)胞,脂肪細(xì)胞和有核細(xì)胞),觀察SVF-gel中人來源的移植物細(xì)胞隨著時(shí)間的變化及轉(zhuǎn)歸,評估新生脂肪細(xì)胞中移植物組織來源的水平。5、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理數(shù)據(jù)使用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS 22.0進(jìn)行數(shù)據(jù)處理,數(shù)據(jù)以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差的方式表示。不同時(shí)間點(diǎn)的分析使用重復(fù)測量資料的方差分析方法,同一時(shí)間點(diǎn)兩組之間比較使用配對樣本t檢驗(yàn)方法。(以P0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義)實(shí)驗(yàn)結(jié)果1、在移植后1天至15天內(nèi),傳統(tǒng)脂肪移植組及SVF-gel移植組兩組的大體外觀及質(zhì)地相似,均由薄層的具有良好血管化的纖維包膜所包裹。而在移植后15天至90天內(nèi),傳統(tǒng)脂肪移植組的體積顯著下降至原有體積的42%± 9%,表面血管化程度較差,且至后期有肉眼可見的油囊形成。而SVF-gel移植組體積則相對保持穩(wěn)定在原有體積的82%± 15%,且具有正常脂肪組織外觀,兩組間有顯著差異(P0.05)。2、傳統(tǒng)脂肪移植組在移植后3天內(nèi)仍能保持正常脂肪結(jié)構(gòu),其后隨著時(shí)間推移小油囊逐漸形成、增多并融合成片,至15天時(shí)組織內(nèi)部可見大片的壞死油囊區(qū)域,并伴有結(jié)締組織的增生和炎癥細(xì)胞浸潤。從30天至90天,盡管在完成血管化的結(jié)締組織內(nèi)有少量新生的小體積脂肪細(xì)胞出現(xiàn)并成熟,但仍有部分大油囊未被完全吸收。而SVF-gel移植后3天內(nèi)迅速地在組織全層良好血管化的結(jié)締組織中出現(xiàn)大量散在的具有多房脂滴的小體積前脂肪細(xì)胞并伴有大量炎癥細(xì)胞浸潤。從15天起,炎癥細(xì)胞數(shù)量逐漸減少,前脂肪細(xì)胞逐漸成熟。至90天絕大多數(shù)纖維結(jié)締組織被成熟脂肪細(xì)胞所替代,僅有少量小油囊形成,相較之下具有更好的組織結(jié)構(gòu)完整性。3、利用馬松三色染色觀察傳統(tǒng)脂肪移植組和SVF-gel移植組中的膠原蛋白,結(jié)果提示在移植第30天后,傳統(tǒng)脂肪移植組出現(xiàn)了大量的結(jié)締組織,其中可見小體積脂肪細(xì)胞新生。而SVF-gel移植組的結(jié)締組織所占據(jù)的體積則在不斷地減少,逐漸表現(xiàn)為正常脂肪組織結(jié)構(gòu)。對于兩組組織纖維化程度的定量分析提示,在移植后30天、60天和90天,傳統(tǒng)脂肪移植組的纖維化程度均顯著高于SVF-gel移植組。4、分別利用Isolectin、Perilipin抗體指示血管和脂肪細(xì)胞,可見傳統(tǒng)脂肪移植組移植后1天具有相當(dāng)多的Perilipin陽性的成熟脂肪細(xì)胞,而第3天后這些細(xì)胞開始死亡,Perilipin陰性區(qū)域逐漸增加,至第15天大部分區(qū)域都是Perilipin陰性的壞死區(qū)及油囊。相比之下,SVF-gel組第1天時(shí)只有少量弱陽性Perilipin表達(dá),但其具有大量Isolectin陽性的血管成分,小體積的新生脂肪細(xì)胞在第三天開始出現(xiàn),逐漸增多并成熟,至移植后15天,新生脂肪連結(jié)成片,且伴隨著血管新生。5、進(jìn)一步利用MAC2、CD206抗體指示Ml型巨噬細(xì)胞和M2型巨噬細(xì)胞對兩組炎癥模式進(jìn)行分析,可見在移植后兩周內(nèi)普通脂肪組具有逐步增多的MAC2陽性、CD206陰性的的M1型巨噬細(xì)胞浸潤。至30天時(shí),這些巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)化為MAC2陽性、CD206陽性的的M2型巨噬細(xì)胞并圍繞著大油滴形成花冠樣結(jié)構(gòu)。而SVF-gel移植組則在7天內(nèi)具有大量的巨噬細(xì)胞浸潤,包繞著組織內(nèi)殘存的小型油滴,隨后炎癥細(xì)胞數(shù)量迅速下降,至30天時(shí)僅有少量M2型巨噬細(xì)胞存留。6、利用HLA抗體對SVF-gel中移植物來源的細(xì)胞進(jìn)行示蹤,可見移植后HLA陽性的區(qū)域逐漸減少,在移植后15天,移植物內(nèi)包含大量體積大小不等,處于不同階段的脂肪細(xì)胞,這些脂肪細(xì)胞均為HLA陰性的。僅在脂肪細(xì)胞間隙中可以見到HLA陽性的細(xì)胞,部分形成血管樣結(jié)構(gòu)。因此,SVF-gel中的大量SVF細(xì)胞群并未直接分化為成熟脂肪細(xì)胞,而是形成了部分新生血管。新生脂肪細(xì)胞幾乎全部來源于宿主。結(jié)論與傳統(tǒng)脂肪移植相比,SVF-gel具有更好的長期體積保留率,并且具有獨(dú)特的脂肪再生模式,即早期大量炎癥細(xì)胞沿細(xì)胞外基質(zhì)迅速浸潤并清除殘存油滴,同時(shí)組織內(nèi)出現(xiàn)散在新生脂肪細(xì)胞。而后隨著新生脂肪逐漸連接成片、新生血管形成,炎癥細(xì)胞逐漸撤退,最終完成穩(wěn)定的組織再生。新生組織中成熟脂肪細(xì)胞主要源自宿主,部分新生血管源自移植物中的SVF細(xì)胞。
【學(xué)位單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R622
【部分圖文】：

圖１－１?ＳＶＦ＿ｇｅｌ的標(biāo)準(zhǔn)化制備流程??Ｆｉｇｕｒｅ?１－１?Ｔｈｅ?ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ?ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ?ｏｆ?ＳＶＦ－ｇｅｌ．??②獲取的ＳＶＦ－ｇｅｌ與傳統(tǒng)Ｃｏｌｅｍａｎ脂肪的對比??制備完成的ＳＶＦ－ｇｅｌ與傳統(tǒng)脂肪進(jìn)行比較，可以發(fā)現(xiàn)經(jīng)過多項(xiàng)純物理手段??處理的ＳＶＦ－ｇｅｌ仍然具有與脂肪組織類似的外觀，其中的成熟脂肪細(xì)胞被破壞??后，大量的油滴釋放并由離心方法去除，最終體積僅占原有體積的１〇％－１５％。??１０??

?＿??驅(qū)權(quán)??ｙ｜華??圖１?２?ＳＶＦ?ｇｅｌ與傳統(tǒng)脂肪大體觀察情況??Ｆｉｇｕｒｅ?１－２?Ｇｅｎｅｒａｌ?ｏｂｓｅｒｖａｔｉｏｎ?ｏｆ?ＳＶＦ－ｇｅｌ?ａｎｄ?ｔｒａｄｉｔｉｏｎａｌ?ｆａｔ．??１．?３．?２移植物大體形態(tài)和體積保留率分析??在移植后１天至１５天內(nèi)，傳統(tǒng)脂肪移植組及ＳＶＦ－ｇｅｌ移植組兩組的人休外??觀及形態(tài)質(zhì)地相似，移植物表面均由薄層的具有良好血管化的纖維包膜所包裹。??而在移植后１５天至３０天內(nèi)，傳統(tǒng)脂肪移植組的體積幵始發(fā)生顯著下降，表面包??膜血管化程度明顯變差，且＾肉眼可見的汕ＩＩ形成。而ＳＶＦ－ｇｅｌ移植組體積則相??對保持穩(wěn)定，且仍具有飽滿的正常脂肪組織外觀，表面包膜血管化情況良好。至??移植后９０天，傳統(tǒng)脂肪移植組體積僅保持在原有體積的４２％±９％，而ＳＶＦ－ｇｅｌ??１１??

?■??Ｄａｙ?１?Ｄａｙ?３?Ｄａｙ?５?Ｄａｙ?７?Ｄａｙ?１１?Ｄａｙ?１５?Ｄａｙ?３０?Ｄａｙ?６０?Ｄａｙ?９０??圖１－３不同時(shí)間點(diǎn)移植物的體積保留率。（上圖）在移植后１５天到９０天內(nèi)，傳統(tǒng)脂肪移植??組的體積迅速下降，同時(shí)可以肉眼可見地觀察到油囊形成包膜表面血管密度下降等變化。相??較之下，ＳＶＦ－ｇｅｌ移植組同期保持著更加穩(wěn)定的體積保留，盡管移植物包膜表面血管密度略??有下降，但在所有時(shí)間點(diǎn)中，ＳＶＦ－ｇｅｌ組移植物的性質(zhì)都是均一而柔軟的，無肉眼可見的油??囊形成。（下圖）對于兩組移植物體積進(jìn)行定量分析提示，ＳＶＦ－ｇｅｌ組在移植后３０天、６０天??和９０天的體積保留率均明顯高于傳統(tǒng)脂肪移植組（＊Ｐ＜０．?０５）。圖片比例尺＝１厘米。??Ｆｉｇｕｒｅ?１?－３?Ｇｒａｆｔ?ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ?ｒａｔｅｓ?ｏｖｅｒ?ｔｉｍｅ．?（Ｕｐｐｅｒ?ｐａｎｅｌ）?Ｔｈｅ?ｖｏｌｕｍｅｓ?ｏｆ?ｆａｔ?ｇｒａｆｔｓ?ｓｈａｒｐｌｙ?ｄｅｃｒｅａｓｅｄ??ｆｒｏｍ?ｄａｙ?１５?ｔｏ?９０，?ａｓ?ｗｅｌｌ?ａｓ?ｓｈｏｗｉｎｇ?ｐｏｏｒ?ｓｕｒｆａｃｅ?ｖａｓｃｕｌａｒｉｚａｔｉｏｎ?ａｎｄ?ｔｈｅ?ｐｒｅｓｅｎｃｅ?ｏｆ?ｖｉｓｉｂｌｅ?ｏｉｌ??ｃｙｓｔｓ．?Ｂｙ?ｃｏｎｔｒａｓｔ，?ｔｈｅ?ｖｏｌｕｍｅｓ?ｏｆ?ＳＶＦ－ｇｅｌｓ?ｇｒａｆｔ?ｒｅｍａｉｎｅｄ?ｒｅｌａｔｉｖｅｌｙ?ｃｏｎｓｔａｎｔ，?ｗｉｔｈ?ｔｈｅｉｒ?ｔｅｘｔｕｒｅ??ｂｅｉｎｇ?ｓｏｆｔ?ａｔ?ａｌｌ?ｔｉｍｅ?ｐｏｉｎｔｓ
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