【摘要】：目的探究負載富血小板纖維蛋白(Platelet-Rich Fibrin,PRF)的新型水凝膠的制備方法及相關性質(zhì),并觀察該水凝膠對兔骨髓間充質(zhì)干細胞(Bone Mesenchymal StemCells,BMSCs)體外成軟骨分化的影響,為臨床進行軟骨缺損的修復提供一種新的水凝膠支架。方法首先制備結合京尼平的殼聚糖溫敏水凝膠。將2%(w/v)殼聚糖(Chitosan,CS)溶液、56%(w/v)β-甘油磷酸鈉(β-glycerophosphate,β-GP)溶液以及 0.1%(w/v)或0.05%(w/v)京尼平溶液按不同體積比混合得到CS/GP、CS/GP/京尼平混合溶液,分別檢測它們在37℃時的成膠時間,觀察大體強度以及體外降解情況;將水凝膠制備成凍干支架后進行掃描電鏡觀察(Scanning Electron Microscope,SEM)、傅里葉紅外光譜分析(Fourier Transform Infrared Spectrometer,FTIR)、溶脹度檢測。再通過一次離心法制備PRF,將PRF凍干后研磨成粉加入上述水凝膠的混合液中,觀察該負載PRF的新型水凝膠體外TGF-βl、IGF-l的緩釋情況,并通過CCK-8(CellCounting Kit-8)法檢測負載PRF的水凝膠凍干支架浸提液的細胞毒性。最后,將BMSCs接種于含有水凝膠的12孔板中,通過二乙酸熒光素(Fluoresceindiacetate,FDA)熒光染色觀察細胞生長情況;再接種BMSCs于24孔板中,進行成軟骨誘導的同時加入負載PRF的新型水凝膠、殼聚糖溫敏水凝膠以及空白對照,培養(yǎng)2周后通過HE染色、番紅O-固綠染色、阿利新藍染色、Ⅱ型膠原免疫組化染色以及采用阿利新藍比色法定量檢測上清液糖胺聚糖(Glycosaminoglycans,GAGs)含量、ELISA競爭法定量檢測上清液Ⅱ型膠原含量,觀察負載PRF的新型水凝膠對BMSCs成軟骨分化的影響情況。結果體積比為6:1:1的CS/GP/0.1%京尼平混合液能夠在37℃下8分鐘左右形成大體強度為5級的水凝膠;該水凝膠在37℃體外環(huán)境下,第7周左右可達到完全降解;SEM結果顯示凍干支架內(nèi)部呈海綿狀多孔結構;傅里葉紅外光譜分析顯示京尼平與CS發(fā)生了交聯(lián)作用;溶脹度為(404.62±105.39)%,提示吸水性良好。TGF-β1、IGF-1等生長因子緩釋檢測結果顯示,負載PRF的新型水凝膠與PRF緩釋生長因子的能力大致相當,差異無明顯統(tǒng)計學意義(P0.05);細胞相容性檢測結果顯示負載PRF的新型水凝膠具有良好的細胞相容性。FDA熒光染色顯示BMSCs在水凝膠表面增殖良好;軟骨相關染色結果顯示負載PRF的新型水凝膠組染色結果均呈陽性,而殼聚糖溫敏水凝膠組和空白對照組呈弱陽性;三組上清液均含有GAGs和Ⅱ型膠原,負載PRF的新型水凝膠分泌量在四周內(nèi)均高于其他兩組,差異具有統(tǒng)計學意義(P0.05)。結論采用體積比為6:1:1的CS/GP/0.1%京尼平的混合溶液能夠形成理化性質(zhì)較好的殼聚糖溫敏水凝膠;負載PRF的新型水凝膠能夠以一定速率緩釋生長因子,該水凝膠具有良好的細胞相容性,并能在一定程度上促進BMSCs成軟骨分化,具有在軟骨組織工程領域的應用前景。
【學位授予單位】：蘇州大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R318.08;R68
【圖文】：

第二章邐負載ＰＲＦ的新型水凝膠對骨髓間充質(zhì)干細胞體外成軟骨分化影響的研宄逡逑３結果逡逑３．１試管倒置法確定成膠情況逡逑室溫下ＣＳ／ｐ－ＧＰ混合溶液呈白色透明、可流動的液態(tài)（圖ｌａ）；置于３７°Ｃ邋—逡逑定時間后即可轉(zhuǎn)變?yōu)槿榘咨煌该�、流動性降低的凝膠態(tài)（圖ｌｂ）。添加京尼平的逡逑水凝膠以其京尼平濃度的由低到高呈現(xiàn)出由淡藍變?yōu)樯钏{的情況。我們實驗中還觀察逡逑到添加０．０５％京尼平的水凝膠初期為淡藍色，放置一段時間后轉(zhuǎn)變?yōu)闇\褐色；添加逡逑０．１％京尼平的水凝膠則始終呈現(xiàn)為深藍色。逡逑

圖１殼聚糖溫敏水凝膠照片逡逑３．２水凝膠的成膠時間及大體強度觀察逡逑由圖２可看出，殼聚糖在配方中的含量是影響水凝膠成膠與否及成膠時間的主要逡逑因素。京尼平的加入并未對水凝膠的成膠時間產(chǎn)生明顯的影響，而根據(jù)自制的殼聚糖逡逑溫敏水凝膠大體強度結果（表２）可看出，京尼平的含量與水凝膠的強度呈正相關，逡逑即京尼平含量越高，所形成的水凝膠強度越強。殼聚糖所占比例也在一定程度上影響逡逑水凝膠的強度：殼聚糖含量越高，水凝膠強度越大。逡逑此外，當殼聚糖所占比例低于３時，混合液在３７°Ｃ中無論放置多久均無明顯成逡逑膠跡象；而當殼聚糖所占比例高于８時，成膠時間均在３０ｍｉｎ以上，由于成膠時間過逡逑長，對于軟骨修復方面的應用受到較大限制。逡逑１４逡逑

邐第二章逡逑典型圖片見圖３。ａ和ｂ示Ａ７水凝膠大體強度觀，可被夾起，但強度較差；ｃ和逡逑ｄ示加入０．０５％京尼平的Ｂ８水凝膠大體強度觀，可被夾起甚至稍用力擠壓；ｅ和ｆ示逡逑加入０．１％京尼平的Ｃ６水凝膠大體強度觀，不僅可被夾起，還能用刀切割塑形。逡逑根據(jù)水凝膠強度、成膠時間等指標進行綜合分析后決定本實驗后期采用Ａ７、Ｂ８、逡逑Ｃ６水凝膠配方進行進一步研究。逡逑邐表２各組水凝膠的成膠時間及大體強度分級邐逡逑Ａ組邐成膠邐大體強邐Ｂ組邐成膠邐大體強邐Ｃ組邐成膠邐大體強度逡逑Ａ１邐不成膠邐0級邐Ｂ１邐不成膠邐0級邐Ｃ１邐不成膠邐0級逡逑Ａ２邐不成膠邐0級邐Ｂ２邐不成膠邐0級邐Ｃ２邐不成膠邐0級逡逑Ａ３邐不成膠邐0級邐Ｂ３邐不成膠邐0級邐Ｃ３邐不成膠邐0級逡逑Ａ４邐３，４９”邐１邐級邐Ｂ４邐５’２９”邐２邐級邐Ｃ４邐４’１８’邐２邐級逡逑Ａ５邐７，２４”邐１邐級邐Ｂ５邐７’３１”邐２邐級邐Ｃ５邐６’２８”邐３邐級逡逑Ａ６邐９’０”邐２邐級邐Ｂ６邐１０’０３”邐３邐級邐Ｃ６邐８’３４”邐４邐級逡逑Ａ７邐１７’３２，，邐３邐級邐Ｂ７邐１７’１８’，邐３邐級邐Ｃ７邐１７’０３”邐４邐級逡逑Ａ８邐３１，３３”邐３邐級邐Ｂ８邐２８’１８”邐４邐級邐Ｃ８邐３１’５５”邐４邐級逡逑Ａ９邐６７，邐３邐級邐Ｂ９邐６８’邐４邐級邐Ｃ９邐６４

【參考文獻】

相關期刊論文 前10條

1 劉強;;組織工程技術修復關節(jié)軟骨的研究現(xiàn)狀與展望[J];中華實驗外科雜志;2017年11期

2 周少懷;范明宇;方紅育;李宏亮;;殼聚糖負載TGF-β1基因修飾骨髓間充質(zhì)干細胞修復兔關節(jié)軟骨缺損的實驗研究[J];湖南師范大學學報(醫(yī)學版);2015年06期

3 Ming ZHAO;Zhu CHEN;Kang LIU;Yu-qing WAN;Xu-dong LI;Xu-wei LUO;Yi-guang BAI;Ze-long YANG;Gang FENG;;新型殼聚糖水凝膠結合軟骨細胞修復兔關節(jié)軟骨缺損的實驗研究(英文)[J];Journal of Zhejiang University-Science B(Biomedicine & Biotechnology);2015年11期

4 于斐;曾暉;于紅燕;雷鳴;袁昊;肖德明;;軟骨細胞特殊染色技術的比較與應用[J];中國比較醫(yī)學雜志;2015年08期

5 張文麗;李淑慧;陳誠;李一鳴;周晶;吳佩玲;;PRF復合自體骨髓間充質(zhì)干細胞修復兔牙槽骨缺損的研究[J];口腔醫(yī)學研究;2015年04期

6 孫迎放;;骨與關節(jié)損傷修復的研究進展[J];中華損傷與修復雜志(電子版);2014年05期

7 李藝楠;李廣峰;馮新民;黃成;肖海祥;楊建東;;骨髓間充質(zhì)干細胞復合溫敏水凝膠支架的制備[J];中國組織工程研究;2013年42期

8 楊勇;楊濤;劉斌;令狐大科;李龍;劉彥普;;自體ADSCs復合PRF修復家兔耳軟骨缺損的實驗研究[J];現(xiàn)代生物醫(yī)學進展;2013年12期

9 馮杰雄;趙文濤;;功能性微創(chuàng)在小兒外科中的應用[J];實用兒科臨床雜志;2012年23期

10 胡志俊;胡波;唐德志;張有為;王世偉;王擁軍;;兔膝關節(jié)軟骨細胞的分離培養(yǎng)及形態(tài)學特征[J];中國組織工程研究與臨床康復;2010年46期

相關碩士學位論文 前1條

1 任曉春;體外軟骨細胞與軟骨單位共培養(yǎng)構建軟骨組織工程種子細胞的最佳比值[D];山西醫(yī)科大學;2013年

本文編號：2803404