【摘要】：目的:aFGF的神經(jīng)保護(hù)作用使其具有應(yīng)用于中樞神經(jīng)損傷修復(fù)的潛能。但其分子量大,生物半衰期短,在體內(nèi)消除迅速,而神經(jīng)損傷修復(fù)是一個(gè)相對(duì)漫長(zhǎng)的過(guò)程,制備一種體內(nèi)緩慢釋放aFGF的新材料為臨床所急需。本實(shí)驗(yàn)室前期合成的磺化殼寡糖(SCOS)具有類肝素的作用,可替代肝素作為aFGF的活性保護(hù)劑,同時(shí)SCOS亦是一種生物活性基質(zhì)材料,可用于水凝膠制備。為此,本研究采用SCOS為載藥材料,輔以殼聚糖和泊洛沙姆,制備一種負(fù)載aFGF溫度敏感型水凝膠,并開(kāi)展其對(duì)脊髓損傷修復(fù)治療藥效學(xué)研究,以拓展aFGF在中樞神經(jīng)損傷修復(fù)治療中的應(yīng)用。方法:(1)建立連二硫酸鈉(Na_2S_2O_4)誘導(dǎo)的RSC96細(xì)胞缺氧-復(fù)氧損傷模型,采用MTT法檢測(cè)細(xì)胞活力,以及測(cè)定乳酸脫氫酶(LDH)的量來(lái)確定RSC96的損傷程度;然后根據(jù)乳酸脫氫酶(LDH)的釋放量,探究磺化殼寡糖、aFGF以及兩者聯(lián)用對(duì)損傷RSC96細(xì)胞的保護(hù)作用,推測(cè)磺化殼寡糖對(duì)aFGF的活性保護(hù)作用;(2)在明確SCOS可提升aFGF神經(jīng)細(xì)胞保護(hù)作用的基礎(chǔ)上,利用泊洛沙姆特殊的可逆溫敏特性,制備了aFGF溫敏水凝膠,通過(guò)掃描電鏡觀察水凝膠內(nèi)部結(jié)構(gòu);酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)測(cè)定aFGF磺化殼寡糖溫敏水凝膠中aFGF的釋放情況;利用小鼠進(jìn)行體內(nèi)生物相容性實(shí)驗(yàn),觀察aFGF磺化殼寡糖溫敏水凝膠的組織相容性。(3)建立大鼠脊髓損傷模型,通過(guò)行為學(xué)(BBB,斜板,神經(jīng)電生理,步態(tài)分析)和形態(tài)學(xué)(HE,Nissl染色)觀察大鼠后肢運(yùn)動(dòng)恢復(fù)及脊髓組織結(jié)構(gòu)變化情況;利用Western Blotting、免疫組化和免疫熒光技術(shù)研究大鼠運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)相關(guān)蛋白變化的情況;利用透射電鏡觀察髓鞘的形態(tài)變化;用血管造影CT成像技術(shù)檢測(cè)損傷部位微血管再生情況;探索aFGF水凝膠對(duì)脊髓損傷修復(fù)的作用機(jī)理。結(jié)果:(1)aFGF與磺化殼寡糖聯(lián)用效果優(yōu)于單獨(dú)使用aFGF,與肝素效果基本相同,表明SCOS能有效的提升aFGF對(duì)Na_2S_2O_4誘導(dǎo)缺氧損傷RSC96細(xì)胞的保護(hù)作用;(2)成功建立了一個(gè)在4℃為液體,32℃以上為膠凝狀態(tài)的溫敏凝膠體系,掃描電鏡發(fā)現(xiàn)此凝膠體系為疏松多孔,呈層狀分布的三維結(jié)構(gòu)。ELISA結(jié)果發(fā)現(xiàn),aFGF磺化殼寡糖溫敏水凝膠對(duì)aFGF具有緩慢釋放的作用,累計(jì)釋放率達(dá)到80%左右。生物相容性結(jié)果顯示,aFGF磺化殼寡糖溫敏水凝膠在體內(nèi)超過(guò)21 d沒(méi)有完全降解,能保證aFGF在體內(nèi)的停留時(shí)間,持續(xù)發(fā)揮藥效;給藥45 d后,沒(méi)有出現(xiàn)炎癥反應(yīng),皮下周圍組織形態(tài)正常,小鼠活動(dòng)正常,表明aFGF磺化殼寡糖溫敏水凝膠具有良好的生物相容性。(3)大鼠脊髓損傷修復(fù)研究中發(fā)現(xiàn),給與aFGF治療后,模型動(dòng)物運(yùn)動(dòng)能力顯著恢復(fù)(P0.05),而aFGF磺化殼寡糖溫敏水凝膠組的效果更優(yōu)于單獨(dú)注射aFGF組。形態(tài)學(xué)顯示aFGF磺化殼寡糖溫敏水凝膠組的脊髓結(jié)構(gòu)較完整,尼氏小體數(shù)量增多。GFAP結(jié)果表明aFGF磺化殼寡糖溫敏水凝膠組給藥28 d后能顯著降低星形膠質(zhì)細(xì)胞的活化程度,減少膠質(zhì)瘢痕的形成。SYN結(jié)果表明aFGF磺化殼寡糖溫敏水凝膠組能顯著促進(jìn)SYN的表達(dá),促進(jìn)軸突的再生和突觸功能的恢復(fù)。髓鞘電鏡觀察結(jié)果發(fā)現(xiàn)aFGF磺化殼寡糖溫敏水凝膠組能夠促進(jìn)髓鞘數(shù)量和厚度以及緊密程度的增加。CD31和VEGF以及血管CT成像結(jié)果表明aFGF磺化殼寡糖溫敏水凝膠組能夠在早期促進(jìn)血管的生成,后期趨于穩(wěn)定,為神經(jīng)元的修復(fù)與再生提供良好的微環(huán)境。結(jié)論:(1)磺化殼寡糖SCOS能有效地提升aFGF的生物學(xué)活性,同時(shí)具有一定緩釋aFGF作用。(2)成功制備了一種具有良好生物相容性的aFGF溫敏水凝膠,與aFGF單獨(dú)用藥相比,aFGF磺化殼寡糖溫敏水凝膠對(duì)神經(jīng)損傷具有更好的修復(fù)作用,有效的提升aFGF的生物學(xué)活性,并通過(guò)單次給藥,長(zhǎng)效釋藥的方式增強(qiáng)aFGF的作用效果,使患者免受多次給藥的痛苦。
【學(xué)位授予單位】：暨南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：TQ427.26;R651.2;R318.08
【圖文】：

暨南大學(xué)碩士學(xué)位論文2.5 數(shù)據(jù)分析數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤差（Mean±SEM）表示，用 GraphpadPrism6.0 軟件作圖并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，采用單因素和雙因素方差分析對(duì)組間進(jìn)行差異性比較， P<0.05 為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。3. 實(shí)驗(yàn)結(jié)果3.1 Na2S2O4對(duì) RSC96 細(xì)胞損傷濃度的摸索通過(guò)倒置顯微鏡，細(xì)胞存活率，LDH 釋放率來(lái)探索 Na2S2O4的損傷濃度。A B

暨南大學(xué)碩士學(xué)位論文和 B 對(duì)比發(fā)現(xiàn)，Na2S2O4損傷后，細(xì)胞明顯萎縮，突起變細(xì)變短，部分細(xì)胞壞死。MTT 結(jié)果顯示，隨著濃度的升高，細(xì)胞存活率具有明顯的差異性（P < 0.01），在 6-8 mm/L 時(shí)細(xì)胞存活率為 60示，隨著濃度的升高，LDH 的釋放率逐漸增加，在 6-10 mm/L ）。結(jié)合 MTT 結(jié)果與 LDH 結(jié)果，最終選擇 8 mmol/LNa2S2O4為究。損傷細(xì)胞的修復(fù)作用發(fā)現(xiàn) aFGF 對(duì)神經(jīng)元具有保護(hù)作用，為了探索最佳濃度，將不同2O4損傷后的 RSC96 細(xì)胞，觀察 aFGF 的損傷修復(fù)與保護(hù)作用，

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前4條

1 吳周睿;朱元貴;程黎明;孫毅;戴建武;曹河圻;董爾丹;;脊髓損傷與修復(fù)的關(guān)鍵科學(xué)問(wèn)題——第81期“雙清論壇”綜述[J];中國(guó)科學(xué)基金;2013年03期

2 吳興杰;馬列;高長(zhǎng)有;;磺化殼聚糖的制備及其對(duì)生長(zhǎng)因子活性的保護(hù)作用[J];高分子學(xué)報(bào);2012年04期

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本文編號(hào)：2730547