【摘要】：研究背景急性胃黏膜損傷(Acute gastric mucosal lesions,AGML)指胃黏膜屏障保護(hù)作用減弱,胃黏膜發(fā)生不同程度的水腫、潰瘍、糜爛和出血,是一種常見的臨床問題。盡管有很多治療急性胃黏膜損傷的藥物,但是胃黏膜損傷經(jīng)常容易復(fù)發(fā),并且患這種疾病病人的數(shù)量一直保持在一個(gè)穩(wěn)定狀態(tài)。過度、持續(xù)性傷害性應(yīng)激是誘發(fā)急性胃黏膜損傷的一個(gè)關(guān)鍵性致病因素,胃是應(yīng)激狀態(tài)下最為敏感的器官之一�，F(xiàn)有研究顯示,各種困難復(fù)雜的手術(shù)、休克、嚴(yán)重感染、膿毒癥、多器官功能障礙綜合征(Multiple organ dysfunction syndrome or failure,MODS or MODF)和嚴(yán)重?zé)齻?chuàng)傷等都可引起AGML。特別是休克引起的低血流灌注,均能減少胃壁血流,損傷胃黏膜屏障,影響胃黏膜上皮細(xì)胞的功能,發(fā)生應(yīng)激性胃黏膜水腫、潰瘍甚至糜爛出血。與應(yīng)激相關(guān)的胃黏膜損傷估計(jì)影響75%以上的急危重病人,其中3%-4%可發(fā)生嚴(yán)重的胃出血,這可使原有疾病加重或惡化,病死率明顯升高。在ICU與應(yīng)激相關(guān)的胃出血發(fā)生率為0.6%-6%。有研究表明應(yīng)激性潰瘍與胃酸分泌增多的關(guān)系不大,更依賴于胃黏膜血流量的減少、缺血缺氧和再灌注損傷。任何影響胃壁血流(Gastric wall blood flow,GWBF)的因素都會對胃黏膜上皮細(xì)胞(Gastric mucosal epithelial cells,GMEC)的功能產(chǎn)生影響,削弱胃黏膜保護(hù)屏障。胃酸增多顯然能加重胃黏膜防御系統(tǒng)的負(fù)荷,但是應(yīng)激性潰瘍時(shí)胃酸一般不高,甚至減少。盡管如此,仍不能否定H~+在應(yīng)激性胃潰瘍發(fā)病中的作用。由于胃黏膜屏障受損,H~+濃度雖然不高,仍可逆行性擴(kuò)散,出現(xiàn)胃壁內(nèi)酸化,則可產(chǎn)生急性胃黏膜損害。此外,一些炎性介質(zhì)的失控和代謝產(chǎn)物也會對胃黏膜的功能產(chǎn)生影響。盡管存在上述一些已經(jīng)明確影響胃黏膜功能的因素,但是應(yīng)激誘導(dǎo)急性胃黏膜損傷的病理生理機(jī)制仍然還不是很清楚�？紤]急性胃黏膜損傷受多因素、多途徑調(diào)控,因此,迫切需要尋找與急性胃黏膜損傷發(fā)病機(jī)制相關(guān)的新的信號分子和信號傳導(dǎo)通路,為防治療急性胃黏膜損傷提供靶點(diǎn)。目前認(rèn)為,AGML的發(fā)生與神經(jīng)和體液等諸多因素有關(guān)。瞬時(shí)受體電位錨蛋白1(Transient receptor potential ankyrin-1,TRPA1)和P物質(zhì)(Substance P,SP)都豐富表達(dá)且共存表達(dá)于大鼠的胃組織和支配胃組織相應(yīng)階段胸8-胸11(T8-11)背根神經(jīng)節(jié)(Dorsal root ganglion,DRG),這樣二者之間可能存在某種相互作用。Kondo T報(bào)道TRPA1參與大鼠內(nèi)臟痛覺過敏的調(diào)節(jié),預(yù)先鞘內(nèi)注射和腹腔注射TRPA1的特異性拮抗劑HC-030031或敲除TRPA1可以有效減輕大鼠胃擴(kuò)張引起的傷害性刺激。給予P物質(zhì)神經(jīng)激肽-1受體拮抗劑SR140333和CP 99994可以分別有效減輕酒精引起的C57/BL6J小鼠胃損傷和SD大鼠浸水束縛應(yīng)激引起的膀胱損傷。有報(bào)道TRPA1和P物質(zhì)均可引起神經(jīng)源性炎癥和非神經(jīng)源性炎癥。在2,4,6-三硝基苯磺酸(2,4,6-trinitrobenzene-sulfonic-acid,TNBS)誘導(dǎo)的小鼠結(jié)腸炎模型,TRPA1對P物質(zhì)的釋放具有調(diào)控作用,但是二者在急性胃黏膜損傷中的作用尚不明確。研究目的冷水束縛應(yīng)激(Water immersion restraint stress,WIRS)因?yàn)槠淞己玫目芍貜?fù)性和臨床相關(guān)性,被廣泛應(yīng)用于應(yīng)激誘導(dǎo)急性胃黏膜損傷的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ�。因�?本課題采用冷水束縛應(yīng)激誘導(dǎo)大鼠急性胃黏膜損傷模型,初步探討:1.冷水束縛應(yīng)激對支配大鼠胃組織相應(yīng)階段背根神經(jīng)節(jié)(T8-11)、胃組織和胃黏膜中TRPA1和P物質(zhì)表達(dá)的影響,觀察TRPA1和P物質(zhì)對急性胃黏膜損傷的作用并探討可能的機(jī)制。2.大鼠鞘內(nèi)、腹腔注射TRPA1特異性拮抗劑HC-030031和口服TRPA1特異性激動(dòng)劑異硫氰酸烯丙酯(Allyl isothiocyanate,AITC),進(jìn)一步觀察TRPA1和P物質(zhì)對急性胃黏膜損傷的影響并探討可能的機(jī)制,以及TRPA1對P物質(zhì)釋放的影響。研究方法雄性Wistar大鼠(weight 180-220g,6 8weeks old),隨機(jī)分為6組,空白對照組(Control group),大鼠未經(jīng)過任何處理;冷水束縛應(yīng)激模型組(WIRS group),大鼠在自制的鼠籠內(nèi)冷水(16±1℃)浸泡6h,水位平大鼠劍突;鞘內(nèi)注射HC-030031組(ITIH group),大鼠冷水束縛應(yīng)激前30min鞘內(nèi)注射HC-030031 10μl(10μg/μl,HC-030031溶解在二甲基亞砜);腹腔注射HC-030031組(IPIH group),大鼠冷水束縛應(yīng)激前1h腹腔注射HC-030031(150 mg/kg,HC-030031溶解在0.5%甲基纖維素)。冷水束縛應(yīng)激6h后,取大鼠的背根神經(jīng)節(jié)(T8-11)、胃組織和胃黏膜。AITC組,口服AITC 17mg/kg(AITC溶解在含有3%乙醇和10%吐溫的生理鹽水中),AITC對照組口服不含有AITC的溶液,2h后,取大鼠的背根神經(jīng)節(jié)(T8-11)、胃組織和胃黏膜,應(yīng)用蘇木素-伊紅染色(Hematoxylin and eosin stain,HE)或戊二醛、四氧化鋨酸固定及一系列處理胃組織后,分別應(yīng)用光學(xué)顯微鏡(Optical Microscope,OM)和透射電子顯微鏡(Transmission electron microscopy,TEM)觀察各組大鼠胃黏膜和胃黏膜細(xì)胞的損傷情況。應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)、蛋白免疫印跡法(Western blot)、免疫組織化學(xué)(IHC)分別檢測背根神經(jīng)節(jié)和胃組織中TRPA1和P物質(zhì)基因水平和蛋白水平表達(dá)的變化。應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測胃黏膜中P物質(zhì)濃度的變化。實(shí)驗(yàn)結(jié)果1.光學(xué)顯微鏡觀察各組大鼠胃組織HE染色胃黏膜損傷情況顯示,未經(jīng)處理的Control組:胃黏膜結(jié)構(gòu)正常,層次清楚,上皮完整,上皮層細(xì)胞排列緊密、規(guī)則,未見壞死脫落;間質(zhì)無水腫及紅細(xì)胞滲出和炎癥細(xì)胞浸潤;固有層腺體排列整齊、密集,未見萎縮和缺失;黏膜下層也未見腫脹及毛細(xì)血管出血傾向和瘀血擴(kuò)張。WIRS組:胃黏膜片狀脫落,多發(fā)淺表潰瘍,有時(shí)可見火山口樣巨大潰瘍�？梢姶罅考毙悦訝�性出血性壞死灶;黏膜層廣泛的上皮細(xì)胞彌漫性凝固壞死脫落,同時(shí)伴有廣泛的紅細(xì)胞滲出和炎性細(xì)胞浸潤,毛細(xì)血管出血及瘀血擴(kuò)張;固有層腺體結(jié)構(gòu)紊亂、萎縮明顯,數(shù)量減少甚至缺失;細(xì)胞間質(zhì)變大水腫;黏膜下層結(jié)構(gòu)疏松水腫、血管淤血擴(kuò)張。與Control組比較,WIRS組胃黏膜損傷評分明顯提高(P0.001)。ITIH組或IPIH組:胃黏膜完整性較好,受損黏膜較表淺局限,僅有輕度充血、水腫,偶見炎性細(xì)胞浸潤;表層上皮有少部分壞死、脫落;局部腺體結(jié)構(gòu)紊亂。與WIRS組比較,ITIH組或IPIH組胃黏膜損傷評分明顯降低(P0.001)。AITC組:可見胃黏膜受損,上皮細(xì)胞壞死脫落;黏膜層水腫,可見紅細(xì)胞滲出和毛細(xì)血管出血;偶見黏膜下層結(jié)構(gòu)疏松水腫和血管淤血擴(kuò)張。與Control比較,AITC組胃黏膜損傷評分明顯提高(P0.001)。2.TEM觀察各組大鼠胃黏膜細(xì)胞損傷情況顯示,未經(jīng)處理的Control組:胃組織上皮細(xì)胞完整;線粒體、粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和細(xì)胞核結(jié)構(gòu)正常。WIRS組:胃組織上皮細(xì)胞變性;廣泛存在主細(xì)胞和/或壁細(xì)胞的細(xì)胞核受損、核周間隙增寬;線粒體受損嚴(yán)重,有些完全失去正常結(jié)構(gòu),輪廓模糊、線粒體嵴減少或消失;粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張甚至空泡變性;緊密連接松散;有些分泌小管極度擴(kuò)張。與Control比較,胃黏膜細(xì)胞損傷評分明顯提高(P0.001)。ITIH組或IPIH組:局部可見線粒體損傷,但線粒體嵴和輪廓存在;粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)局部擴(kuò)張,空泡變性基本消失;緊密連接結(jié)構(gòu)正常;未見分泌小管擴(kuò)張。與WIRS組比較,ITIH組或IPIH組胃黏膜細(xì)胞損傷評分明顯降低(P0.001)。AITC組:可見胃組織的主細(xì)胞和/或壁細(xì)胞核受損、周間隙增寬;可見線粒體損傷,多伴有線粒體嵴減少或消失,但輪廓存在;粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)局部擴(kuò)張,偶發(fā)空泡變性;偶見分泌小管擴(kuò)張。與Control組比較,AITC組胃黏膜細(xì)胞損傷評分明顯提高(P0.001)。3.同Control組比較,WIRS組大鼠背根神經(jīng)節(jié)(T8-11)和胃組織中TRPA1和P物質(zhì)基因水平和蛋白水平表達(dá)上調(diào)、胃黏膜中P物質(zhì)釋放增加(P0.001)。4.同WIRS組比較,鞘內(nèi)或腹腔注射TRPA1的特異性拮抗劑HC-03003(1ITIH組或IPIH組),有效減輕WIRS誘導(dǎo)的大鼠急性胃黏膜損傷和抑制背根神經(jīng)節(jié)(T8-11)、胃組織和胃黏膜中P物質(zhì)釋放(P0.001)。5.同Control組比較,口服TRPA1特異性激動(dòng)劑AITC,誘導(dǎo)大鼠胃黏膜中度損傷,大鼠背根神經(jīng)節(jié)(T8-11)、胃組織和胃黏膜中P物質(zhì)的釋放明顯增加(P0.001)。結(jié)論1.冷水束縛應(yīng)激誘導(dǎo)大鼠急性胃黏膜損傷,使背根神經(jīng)節(jié)(T8-11)和胃組織中TRPA1和P物質(zhì)的表達(dá)上調(diào)、胃黏膜中P物質(zhì)的釋放增加。應(yīng)激誘導(dǎo)的急性胃黏膜損傷與TRPA1和P物質(zhì)的激活密切相關(guān),其機(jī)制可能是二者的激活引起神經(jīng)元性和非神經(jīng)源性炎癥以及內(nèi)臟痛覺過敏。2.TRPA1拮抗劑HC-030031明顯改善冷水束縛應(yīng)激引起的大鼠急性胃黏膜損傷,其機(jī)制可能是HC-030031顯著抑制TRPA1的表達(dá)和P物質(zhì)在背根神經(jīng)節(jié)、胃組織和胃黏膜中的釋放,減輕其在胃組織引起的神經(jīng)源性和非神經(jīng)源性炎癥及內(nèi)臟痛覺過敏。3.TRPA1激動(dòng)劑AITC,誘導(dǎo)大鼠胃黏膜中度損傷和P物質(zhì)在大鼠背根神經(jīng)節(jié)(T8-11)、胃組織和胃黏膜中的釋放明顯增加。4.在應(yīng)激誘導(dǎo)的AGML的大鼠模型中,P物質(zhì)的釋放主要由TRPA1調(diào)控。
【學(xué)位授予單位】：中國人民解放軍海軍軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R614
【圖文】：

二、實(shí)驗(yàn)結(jié)果( )冷水束縛應(yīng)激誘導(dǎo)大鼠急性胃黏膜損傷1、光學(xué)顯微鏡觀察 2 組大鼠急性胃黏膜損傷情況未經(jīng)處理的 Control 組：胃黏膜結(jié)構(gòu)正常，層次清楚，р皮完整，р皮層細(xì)胞排列緊密、規(guī)則，未見壞死脫落；間質(zhì)無水腫及紅細(xì)胞滲出和炎性細(xì)胞浸潤；固有層腺體排列整齊、密集，未見萎縮和缺失；黏膜н層也未見腫脹及毛細(xì)血管出血傾向和瘀血擴(kuò)張。WIRS 組：胃黏膜片狀脫落，多發(fā)淺表潰瘍，有時(shí)可見火山口樣巨大潰瘍。大量急性糜爛性出血性壞死灶；黏膜層廣泛的р皮細(xì)胞彌漫性凝固壞死脫落，同時(shí)伴有廣泛的紅細(xì)胞滲出和炎性細(xì)胞浸潤，毛細(xì)血管出血及瘀血擴(kuò)張；固有層腺體結(jié)構(gòu)紊亂、萎縮明顯，數(shù)量減少甚至缺失；細(xì)胞間質(zhì)變大水腫；黏膜н層結(jié)構(gòu)疏松水腫、血管淤血擴(kuò)張。у Control 組比較，WIRS 組胃黏膜損傷評分明顯提高(0.00±0.00vs7.66±1.645, **P <0.001)，結(jié)果見圖 1。

海軍軍醫(yī)大學(xué)博士學(xué)位論文2、TEM 觀察 2 組大鼠胃黏膜細(xì)胞損傷情況。Control 組：胃組織р皮細(xì)胞完整；線粒體、粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和細(xì)胞核結(jié)構(gòu)正常。WIRS組：胃組織р皮細(xì)胞變性；廣泛存在主細(xì)胞和/或壁細(xì)胞的細(xì)胞核受損、核周間隙增寬；線粒體受損嚴(yán)重，有些完全失去正常結(jié)構(gòu)，輪廓模糊、線粒體嵴消失；粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張甚至空泡變性；緊密連接松散；有些分泌小管極度擴(kuò)張。у Control 組比較，WIRS 組胃黏膜細(xì)胞損傷評分明顯提高(0.00±0.00 vs3.944±0.639, **P<0.001)，結(jié)果見圖 2。

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前2條

1 李成龍;屠偉峰;丁東;;舒芬太尼預(yù)處理對大鼠急性胃黏膜病變組織中TNF-α mRNA與IL-1β mRNA表達(dá)的影響[J];熱帶醫(yī)學(xué)雜志;2010年06期

2 丁冬;屠偉峰;李成龍;;氯胺酮預(yù)處理對大鼠應(yīng)激性潰瘍的保護(hù)作用[J];實(shí)用醫(yī)學(xué)雜志;2008年02期

本文編號：2722952