發(fā)布時(shí)間：2020-05-09 08:30

【摘要】：研究背景與目的急性肢體缺血(acute limb ischemia,ALI)是由動(dòng)脈栓子、動(dòng)脈血栓形成或者動(dòng)脈損傷導(dǎo)致的肢體遠(yuǎn)端動(dòng)脈血流突然中斷,是血管外科最常見(jiàn)的動(dòng)脈性疾病之一。近年來(lái),對(duì)于該病的診斷和治療較以往都有了顯著地進(jìn)步,但是其仍然導(dǎo)致較高的截肢率和病死率。但是肢體血運(yùn)恢復(fù)后,常導(dǎo)致肢體缺血/再灌注(ischemia/reperfusion,IR)損傷,引起肌肉組織和血管組織損傷,以及遠(yuǎn)隔器官如心、肺、腎、腸道等器官等組織的炎性損傷等,嚴(yán)重者可導(dǎo)致代謝性酸中毒,高鉀血癥,急性腎功能衰竭,多器官功能障礙綜合征,甚至造成病人死亡。缺血刺激及缺血后再灌注均可引發(fā)炎癥因子介導(dǎo)的炎癥瀑式反應(yīng),是導(dǎo)致缺血性損傷以及再灌注損傷的重要原因。在急性肢體缺血/再灌注過(guò)程中,血管組織發(fā)生的炎癥反應(yīng),常會(huì)引起包括腫瘤壞死因子-α(TNF-α),白介素(interleukin,IL)在內(nèi)的多種炎癥因子的合成與分泌,刺激細(xì)胞間粘附分子(intercellular adhesion molecule,ICAM)、血管細(xì)胞粘附分子(Vascular celladhesion molecule,VCAM)表達(dá)上調(diào),趨化聚集白細(xì)胞,對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞和血管平滑肌細(xì)胞造成炎性損傷。我們認(rèn)為減輕甚至消除血管組織本身的炎癥反應(yīng)可以起到保護(hù)血管功能的作用,有利于減輕肢體缺血/再灌注后造成的炎性損傷。高遷移率族蛋白 B1(High mobility group box protein 1,HMGB1)是一種高度保守的DNA結(jié)合非組蛋白,廣泛存在于真核生物的細(xì)胞核內(nèi),其在核內(nèi)可以維持核小體結(jié)構(gòu)、穩(wěn)定染色質(zhì)、調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄、參與DNA重組以及修飾類固醇激素受體。研究發(fā)現(xiàn),HMGB1釋放到細(xì)胞外時(shí)作為炎癥因子廣泛參與了缺血/再灌注損傷、組織損傷后修復(fù)、動(dòng)脈粥樣硬化、炎癥反應(yīng)等病理生理過(guò)程。HMGB1作為早期炎癥因子引發(fā)的炎癥瀑式反應(yīng)可導(dǎo)致缺血/再灌注損傷,其可以上調(diào)ICAM、VCAM的表達(dá),刺激巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞等產(chǎn)生TNF-α、ILs,促進(jìn)白細(xì)胞粘附和血小板聚集,進(jìn)一步趨化巨噬細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞遷移等。研究發(fā)現(xiàn),HMGB1在心、腦、肺、肝、腎、腸道和骨骼肌組織的缺血/再灌注過(guò)程中均有強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá),而且以HMGB1為靶點(diǎn)的治療措施可明顯減輕實(shí)質(zhì)臟器和肌肉組織的再灌注損傷。我們將在本研究中檢測(cè)人急性肢體缺血再灌注損傷血漿中HMGB1的表達(dá),并檢測(cè)大鼠模型中股動(dòng)脈組織及肝、肺組織中HMGB1的表達(dá),觀察其在缺血再灌注損傷炎癥反應(yīng)中的作用。HMGB1在胞外發(fā)揮作用主要是通過(guò)與其受體結(jié)合來(lái)實(shí)現(xiàn)的。目前胞外HMGB1的受體主要有晚期糖蛋白終末產(chǎn)物受體(receptor for advanced glycation end products,RAGE)及 Toll 樣受體 2/4(Toll-like receptors 2/4,TLR 2/4)。研究發(fā)現(xiàn)胞外的HMGB1與相應(yīng)受體結(jié)合后發(fā)揮其生物學(xué)作用,與受體結(jié)合后可以啟動(dòng)炎性反應(yīng)。Toll樣受體(Toll-like receptors,TLRs)是一種病原體功能識(shí)別的跨膜受體,可以識(shí)別細(xì)菌,病毒以及其它一些病原體。目前已知,TLRs在免疫應(yīng)答和介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)的炎癥反應(yīng)中有著很重要的作用。TLRs被激活后,通過(guò)各自的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路,激活下游轉(zhuǎn)錄因子,可以使宿主細(xì)胞產(chǎn)生大量的炎癥因子。TLRs的傳導(dǎo)通路一般分為二條,分別是MyD88和Trif依賴性通路。TLR2僅通過(guò)MyD88通路下傳信號(hào),而TLR4有以上兩條傳遞信號(hào)通路。這兩條通路通過(guò)細(xì)胞內(nèi)的激酶激活轉(zhuǎn)錄因子,比如核因子NF-κB,產(chǎn)生促炎因子,比如TNF、IL和干擾素(Interferon,IFN)。TLR4介導(dǎo)的信號(hào)通路包括髓樣細(xì)胞分化因子88(myeloid differentiation factor 88,MyD88)依賴性途徑和MyD88非依賴性途徑。絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases,MAPK)通路主要包含細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶 1 和 2(extracellular signal-regulated protein kinase 1 and 2,ERK1/2)、c-Jun N 端激酶(c-Jun N-terminal kinase,JNK)和 p38 蛋白激酶通路。MAPK作為T(mén)LR4下游信號(hào)分子介導(dǎo)MyD88依賴性途徑,最終活化核轉(zhuǎn)錄因子(nuclear factor kappa B,NF-κ B),誘導(dǎo)一系列特定基因表達(dá),引起炎性細(xì)胞因子釋放進(jìn)而造成再灌注后細(xì)胞損傷。但是HMGB1在急性肢體缺血/再灌注過(guò)程中特別是該過(guò)程血管組織損傷中與哪個(gè)或哪些受體相結(jié)合,激活了怎樣的下游通路尚不明確。在本研究中,我們將檢測(cè)HMGB1-TLR4-MyD88-NF-κ B-TNF α、IL-6信號(hào)通路蛋白及炎癥因子在缺血再灌注損傷股動(dòng)脈中的表達(dá),并分別應(yīng)用HMGB1抑制劑Ethylpyruvate和TLR4抑制劑TAK-242預(yù)處理,觀察通路蛋白及炎癥因子的變化,研究其在肢體缺血再灌注動(dòng)脈損傷中的作用。本研究將通過(guò)檢測(cè)人血漿中HMGB1及炎癥因子的表達(dá),研究其在急性下肢缺血再灌注損傷中的作用;構(gòu)建急性肢體缺血/再灌注大鼠模型,對(duì)肢體血管組織炎癥反應(yīng)過(guò)程以及HMGB1-TLR4-MyD88-NF-κ B信號(hào)通路在此過(guò)程中具體的作用機(jī)制進(jìn)行了深入的研究,研究結(jié)果可以從炎癥因子的角度闡釋急性缺血/再灌注過(guò)程中血管組織的病理改變,并將為急性肢體缺血再灌注損傷的臨床治療提供理論依據(jù)和新的線索。研究?jī)?nèi)容第一部分:HMGB1在急性下肢缺血再灌注損傷血漿中的表達(dá)及意義第二部分:HMGB1及TLR4-MyD88-NF-κ B信號(hào)通路在肢體缺血再灌注過(guò)程動(dòng)脈損傷中的作用及機(jī)制研究研究方法第一部分1.選擇2017年1月至2017年12月因急性肢體缺血于發(fā)病6小時(shí)內(nèi),在我院行股動(dòng)脈切開(kāi)取栓治療的患者21例為手術(shù)組(均為急性動(dòng)脈栓塞),另選擇下肢造影正常者10例為健康對(duì)照組。兩組分別于術(shù)前10分鐘、術(shù)后24小時(shí)、術(shù)后48小時(shí)留取靜脈血5ml,離心后置于-80℃冰箱保存。2.Elisa 檢測(cè)血清中 HMGB1、IL-6、TNF-a 水平。第二部分1.動(dòng)物模型的建立和分組:將Wistar雄性大鼠分為正常組、假手術(shù)組、缺血再灌注組。利用血管夾阻斷股動(dòng)脈結(jié)合橡皮筋環(huán)扎后肢根部建立急性肢體缺血模型,缺血6小時(shí)后取出血管夾和止血帶,開(kāi)放血流12h建立缺血再灌注模型。2.收集標(biāo)本:再灌注12h后處死大鼠,收集股動(dòng)脈、下腔靜脈血備用。3.用HE染色法觀察血管組織形態(tài)及結(jié)構(gòu)的病理改變。4.免疫組織化學(xué)染色法觀察股動(dòng)脈組織中HMGB1、TNF-a、IL-6的表達(dá)情況。5.用Western blot方法檢測(cè)動(dòng)脈血管中HMGB1、TLR4、MyD88、NF-κ B蛋白的表達(dá)水平。6.用SyberGreen實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法檢測(cè)動(dòng)脈血管中HMGB1、TLR4、MyD88、NF-κ BmRNA的表達(dá)水平。研究結(jié)果第一部分1.兩組患者年齡(歲)、性別、吸煙率(%)、高血壓患病率(%)、糖尿病患病率(%)、血脂(mmol/L)、肌酐(μmol/L)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(mmol/L)水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。2.ALI手術(shù)組與健康對(duì)照組相比,各時(shí)間點(diǎn)血漿HMGB1水平均高于相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)健康對(duì)照組(P0.01)。ALI手術(shù)組與健康對(duì)照組,兩組血漿HMGB1水平于術(shù)后24小時(shí)較術(shù)前即刻均出現(xiàn)了明顯增高(P0.01),且兩組血漿HMGB1水平于術(shù)后48小時(shí)較術(shù)后24小時(shí)出現(xiàn)了明顯下降(P0.01),而兩組血漿HMGB1水平于術(shù)后48小時(shí)較術(shù)前即刻差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。3.ALI手術(shù)組與健康對(duì)照組相比,各時(shí)間點(diǎn)血漿IL-6水平均高于相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)健康對(duì)照組(P0.01)。ALI手術(shù)組與健康對(duì)照組,兩組血漿IL-6水平于術(shù)后24小時(shí)較術(shù)前即刻出現(xiàn)了明顯增高(P0.01),但兩組血漿IL-6水平于術(shù)后48小時(shí)較術(shù)后24小時(shí)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),且兩組血漿IL-6水平于術(shù)后48小時(shí)較術(shù)前即刻仍明顯升高(P0.01)。4.ALI手術(shù)組與健康對(duì)照組相比,各時(shí)間點(diǎn)血漿TNF-α水平均高于相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)健康對(duì)照組(P0.01)。ALI手術(shù)組與健康對(duì)照組,兩組血漿TNF-α水平于術(shù)后24小時(shí)較術(shù)前即刻出現(xiàn)了明顯增高(P0.01),且兩組血漿TNF-α水平于術(shù)后48小時(shí)較術(shù)后24小時(shí)出現(xiàn)了明顯下降(P0.01),但是兩組血漿TNF-α水平于術(shù)后48小時(shí)較術(shù)前即刻仍明顯升高(P0.01)。5.ALI手術(shù)組與健康對(duì)照組,兩組對(duì)應(yīng)時(shí)間點(diǎn)血漿HMGB1水平與IL-6水平相關(guān)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P0.05),而兩組對(duì)應(yīng)時(shí)間點(diǎn)血漿HMGB1水平與TNF-α水平呈正相關(guān)(P0.01)。第二部分1.成功建立大鼠后肢急性缺血再灌注模型;與正常組和假手術(shù)組相比,急性肢體缺血再灌注大鼠模型組血漿中HMGB1表達(dá)明顯升高(P0.01),大鼠股動(dòng)脈管壁中 HMGB1、IL-6、TNF-α 表達(dá)明顯升高;血管組織中 HMGB1、TLR4、MyD88、NF-κ B表達(dá)在缺血再灌注組較假手術(shù)組明顯升高(P0.01),在EP預(yù)處理組,上述指標(biāo)較缺血再灌注組均有明顯下降(P0.01),但比假手術(shù)組仍明顯升高(P0.05);而在TAK-242預(yù)處理后,HMGB1較缺血再灌注組無(wú)明顯變化,TLR4、MyD88、NF-κ B較缺血再灌注組均有不同程度的下降(P0.05),TLR4、MyD88下降明顯(P0.01),NF-κ B下降幅度較小(P0.05);與EP+IS組相比,TAK-242+IS組HMGB1表達(dá)量較高(P0.05),TLR4無(wú)明顯差別(P0.05),MyD88表達(dá)略高,但無(wú)意義(P0.05),NF-KB表達(dá)升高(P0.05)。2.假手術(shù)組可見(jiàn)內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞大致正常,彈力纖維層結(jié)構(gòu)正常;缺血再灌注組可見(jiàn)血管壁膠原纖維的降解,彈力層的波浪狀結(jié)構(gòu)被破壞,部分內(nèi)皮細(xì)胞消失,平滑肌細(xì)胞數(shù)量減少,并可見(jiàn)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。EP+缺血再灌注組可見(jiàn)血管壁膠原纖維部分降解,彈力層的波浪狀結(jié)構(gòu)部分被破壞,部分內(nèi)皮細(xì)胞消失,平滑肌細(xì)胞數(shù)量減少,并可見(jiàn)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)減少;TAK-242+缺血再灌注組基本同EP+缺血再灌注組。3.免疫組化顯示:缺血再灌注組HMGB1、TNF-a、IL-6的表達(dá)明顯升高(P0.01),廣泛存在于內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞,但是其表達(dá)強(qiáng)度各不相同。4.Western blot結(jié)果顯示:實(shí)驗(yàn)組血管組織中HMGB1、TLR4、MyD88、NF-κB的表達(dá)明顯升高(P0.01);HMGB1在EP+缺血再灌注組較缺血再灌注組明顯降低(P0.05),TAK-242+缺血再灌注組較缺血再灌注組無(wú)明顯變化(P0.05),但較EP+缺血再灌注組高(P0.05)。TLR4在EP+缺血再灌注組較缺血再灌注組明顯降低(P0.05),TAK-242+缺血再灌注組較缺血再灌注組明顯降低(P0.05),TAK-242+缺血再灌注組較EP+缺血再灌注組無(wú)明顯變化(P0.05)。MyD88在在EP+缺血再灌注組較缺血再灌注組明顯降低(P0.05),TAK-242+缺血再灌注組較缺血再灌注組明顯降低(P0.05),但較EP+缺血再灌注組略高,但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。NF-κB在EP+缺血再灌注組較缺血再灌注組明顯降低(P0.01),TAK-242+缺血再灌注組較缺血再灌注組明顯降低(P0.05),EP+缺血再灌注組較TAK-242+缺血再灌注組低(P0.05)。5.SyberGreen實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果:缺血再灌注組血管壁組織中HMGB1、TLR4、MyD88、NF-κB、TNF-a、IL-6mRNA 水平明顯升高(P0.01)。HMGB1、TLR4、MyD88、NF-κB mRNA 的表達(dá)水平同 Western一致。TNF-a、IL-6mRNA水平在EP+缺血再灌注組較缺血再灌注組明顯降低(P0.01),TAK-242+缺血再灌注組較缺血再灌注組明顯降低(P0.05),EP+缺血再灌注組較TAK-242+缺血再灌注組低(P0.05)結(jié)論1.急性肢體缺血后再灌注可導(dǎo)致全身組織發(fā)生炎癥反應(yīng),血漿中高表達(dá)HMGB1,是炎癥細(xì)胞因子的重要來(lái)源。HMGB1發(fā)揮作用可能是通過(guò)調(diào)節(jié)IL-6、TNF-a實(shí)現(xiàn)的,但其具體作用機(jī)制不明。2.應(yīng)用血管夾及橡皮筋結(jié)合可成功構(gòu)建急性肢體缺血再灌注大鼠模型,可導(dǎo)致動(dòng)脈血管組織及全身發(fā)生炎癥反應(yīng)。急性肢體缺血再灌注動(dòng)脈血管組織及血漿中大量表達(dá)HMGB1,是炎癥細(xì)胞因子的重要來(lái)源。其作用可能是通過(guò)上調(diào)相關(guān)炎癥因子的表達(dá)來(lái)實(shí)現(xiàn)的。3.HMGB1在缺血再灌注動(dòng)脈損傷中的作用是通過(guò)HMGB1-TLR4-MyD88-NF-κ B信號(hào)通路實(shí)現(xiàn)的,但不完全是依靠HMGB1-TLR4-MyD88-NF-κB信號(hào)通路實(shí)現(xiàn)的。4.HMGB1抑制劑Ethyl pyruvate和TLR4抑制劑TAK-242可減輕缺血再灌注過(guò)程動(dòng)脈損傷的炎癥反應(yīng),減輕組織損傷,為急性肢體缺血再灌注損傷的臨床治療提供理論依據(jù)。
【圖文】：

圖２．邋１大鼠后肢實(shí)驗(yàn)圖逡逑

邐Ｓｈｍｕ邐ＩＲ逡逑ｊｍ逡逑圖２．２大鼠后肢血管ＨＥ染色圖逡逑注：正常：未進(jìn)行任何操作的實(shí)驗(yàn)大鼠；Ｓｈａｍ：假手術(shù)組；ＩＲ：缺血再灌注模逡逑型組；逡逑２．３急性肢體缺血再灌注大鼠血漿中ＨＭＧＢ１表達(dá)明顯升氋逡逑本研究對(duì)急性肢體缺血再灌注大鼠血漿中的ＨＭＧＢ１水平進(jìn)行了邋ＥＬＩＳＡ檢測(cè)，，逡逑通過(guò)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，兩組大鼠－假手術(shù)組和正常組的ＨＭＧＢ１水平?jīng)]有明顯差別，都顯逡逑示正常穩(wěn)定狀態(tài)，其差異在統(tǒng)計(jì)學(xué)上也沒(méi)有意義，（Ｐ＞0．邋０５）。與正常和假手術(shù)逡逑組大鼠相比。ＩＲ模型大鼠血漿中ＨＭＧＢ１水平較高，和正常組以及假手術(shù)組的大逡逑鼠之間的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，（Ｐ〈0．0ｌ）。上述結(jié)果表明，ＨＭＧＢ１可能在缺血逡逑再灌注中發(fā)揮一定的作用。逡逑吾邋０．８＊１邐＊逡逑（Ａ）逡逑正常邋Ｓｈａｍ邋１Ｒ邐■逡逑邐邐邋ＨＭＧＢｌ邋ｉ逡逑ＡＣＴＩＮ邐０．２－邋邐邋邐逡逑Ｉ逡逑｜0．0ｌｌ邋，邐ｌ．，Ｊ—１＾－逡逑ＵＪ
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R654.4

【參考文獻(xiàn)】

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1 Jie Wang;Gui-Zhen He;Yu-Kang Wang;Qian-Kun Zhu;Wei Chen;Tai Guo;;TLR4-HMGB1-, MyD88- and TRIF-dependent signaling in mouse intestinal ischemia/reperfusion injury[J];World Journal of Gastroenterology;2015年27期

2 邵壯;熊江;郭偉;衛(wèi)任;;烏司他丁對(duì)大鼠肢體缺血再灌注損傷的保護(hù)作用及其機(jī)制[J];臨床和實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志;2014年10期

3 王發(fā)龍;陳文;王振興;陳靜瑜;衛(wèi)棟;陳國(guó)千;;高遷移率族蛋白B1在大鼠移植肺缺血再灌注損傷中的作用[J];實(shí)用醫(yī)學(xué)雜志;2013年05期

4 李培志;吳傳新;龔建平;;HMGB1在缺血-再灌注損傷中的作用機(jī)制研究進(jìn)展[J];生理科學(xué)進(jìn)展;2011年02期

5 張江鋒;覃曉;李U

本文編號(hào)：2655867