【摘要】：研究目的:褪黑素是一種主要由松果體合成的激素,與骨科疾病如特發(fā)性脊柱側凸(idiopathic scoliosis,IS)的發(fā)生和發(fā)展密切相關�，F(xiàn)有的研究尚不能明確地闡明褪黑素分泌量和節(jié)律性與特發(fā)性脊柱側凸和骨質疏松癥發(fā)生發(fā)展的關系,及補充褪黑素是否能阻止上述疾病的發(fā)展。我們的前期實驗證實,褪黑素對成骨細胞具有雙重效應,并存在濃度依賴性,低濃度褪黑素促進成骨細胞增殖,而高濃度褪黑素抑制成骨細胞增殖。經(jīng)過我們的實驗驗證:低濃度褪黑素作用于成骨細胞褪黑素受體,與G蛋白結合,激活IP3,引起Ca~(2+)濃度上升,通過調節(jié)CaMKs/MEK/ERK通路,促進成骨細胞的增殖;隨著褪黑素濃度的增加,達到較高濃度時,上述機制被抑制,激活細胞膜鈣離子通道,細胞外鈣離子進入細胞內,導致細胞內鈣離子濃度穩(wěn)態(tài)失調,引起鈣超載,進而抑制成骨細胞增殖。我們前期也證實高濃度褪黑素可以引起鈣超載,抑制成骨細胞增殖,誘導凋亡。本課題擬在前期研究的基礎上,全面深入探討褪黑素誘導成骨細胞凋亡的作用機制,闡明褪黑素通過Septin7誘導的成骨細胞內質網(wǎng)應激與細胞自噬和凋亡的相關性,為褪黑素治療特發(fā)性脊柱側凸提供理論依據(jù)及新的思路。研究方法:1、MTT檢測褪黑素對成骨細胞增殖的影響;2、Annexin V-FITC/PI染色流式細胞術檢測褪黑素對成骨細胞凋亡率;3、Hoechst33342染色檢測褪黑素對細胞核內染色質凝集的影響;4、MDC染色觀察褪黑素對成骨細胞自噬的影響;5、應用Septin7 siRNA沉默Septin7表達,證實褪黑素作用于Septin7引起成骨細胞內質網(wǎng)應激;6、SEPT 7過表達質粒,轉染到Septin7 siRNA穩(wěn)定的成骨細胞中,進一步證實褪黑素作用于Septin7引起成骨細胞內質網(wǎng)應激7、應用于內質網(wǎng)應激抑制劑4PBA、自噬抑制劑3MA,闡明褪黑素誘導的成骨細胞內質網(wǎng)應激與細胞自噬和凋亡的相關性,研究結果:1、高濃度褪黑素抑制成骨細胞增殖MTT結果發(fā)現(xiàn)高濃度褪黑素(1、2、4、8mmol/L)作用成骨細胞24h、48h、72h后,細胞增殖率均有下降,其中較高濃度(2、4、8mmol/L)作用6h后,細胞增殖率也有下降,且與對照組相比差異有統(tǒng)計學意義(P0.05),其中褪黑素濃度為2mmol/L作用時間為24h時,細胞增殖率明顯下降。2、高濃度褪黑素誘導成骨細胞凋亡Annexin V-FITC/PI雙標染色流式細胞術顯示,當褪黑素作用成骨細胞24h,濃度達到2mmol/L時,成骨細胞早期及晚期凋亡明顯增加,并隨褪黑素濃度增大而增加,與對照組相比,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05)。單獨應用內質網(wǎng)應激抑制劑4PBA及自噬抑制劑3MA對細胞凋亡無明顯影響,當聯(lián)合高濃度褪黑素作用于成骨細胞時,其誘導的凋亡程度明顯增強。3、高濃度褪黑素引起成骨細胞核內致密濃染,產(chǎn)生凋亡小體Hoechst33342熒光染色結果顯示,當1mM褪黑素作用成骨細胞24h,細胞核出現(xiàn)致密濃染,濃度達2mM及以上時,細胞形態(tài)上可見部分細胞呈碎塊狀致密濃染,并產(chǎn)生凋亡小體,細胞凋亡明顯。4、高濃度褪黑素誘導成骨細胞自噬單丹磺酰尸胺MDC染色結果顯示,2mM褪黑素作用成骨細胞24h,細胞內可見熒光強度明顯增強的自噬小體。5、褪黑素誘導成骨細胞內質網(wǎng)應激與自噬和凋亡的相關性Western blot結果顯示,2mM褪黑素作用成骨細胞24h、48h,可以引起凋亡標志蛋白PARP-1的切割。同時發(fā)現(xiàn)2mM褪黑素作用成骨細胞6h、24h、48h,均可以引起自噬標志性蛋白LC3-II的表達上調及內質網(wǎng)應激標志性蛋白GRP78和CHOP的表達增加。單獨應用內質網(wǎng)應激抑制劑4PBA時對細胞凋亡標志蛋白PARP-1無明顯影響,當4PBA及自噬抑制劑3MA聯(lián)合高濃度褪黑素作用于成骨細胞時,可以增加其誘導的凋亡程度。6、Septin7與褪黑素誘導內質網(wǎng)應激的相關性為更好地了解褪黑素誘導的成骨細胞septin7與褪黑素誘導內質網(wǎng)應激的關系,septin7 siRNA干擾septin7的表達,結果發(fā)現(xiàn),轉染siRNA septin7成骨細胞可顯著降低GRP 78和CHOP的表達,即使與褪黑素聯(lián)合使用,變化也不顯著,證實褪黑素介導的ER應激誘導成骨細胞增殖是通過作用于septin7的表達。我們還研究了外源表達的septin7是否能逆轉septin7基因敲除引起的GRP 78的抑制和CHOP的表達,通過septin7過表達質粒轉染siRNA septin7成骨細胞,Westernblot檢測7、GRP78和CHOP蛋白水平。如圖8A,B所示,在褪黑素誘導的siRNA septin7成骨細胞中,外源性septin7恢復了septin7的表達,我們還發(fā)現(xiàn),成骨細胞的GRP 78和CHOP表達明顯高于對照組,但是一個有趣的發(fā)現(xiàn)是septin7的表達并沒有改變。研究結論1、高濃度褪黑素作用于成骨細胞,抑制成骨細胞增殖,引起成骨細胞發(fā)生內質網(wǎng)應激,引起成骨細胞發(fā)生自噬,誘導成骨細胞凋亡。2、內質網(wǎng)應激與自噬出現(xiàn)在高濃度褪黑素作用的早期,二者共同起到保護細胞的促存活作用,后期過度內質網(wǎng)應激引起自噬性凋亡誘導成骨細胞凋亡,而septin7是褪黑素誘導的內質網(wǎng)應激的靶蛋白。
【圖文】：

中國醫(yī)科大學博士學位論文3 實驗結果.1 高濃度褪黑素抑制成骨細胞增殖人成骨細胞系 hFOB1.19 是一種非常好的細胞增殖研究模型。我們的前期實實，低濃度褪黑素可以促進成骨細胞的增殖。為了研究高濃度褪黑素對成骨細殖的影響，我們進行了 MTT 實驗。如圖 1 所示，MTT 結果表明：高濃度褪黑素(1、2、4、8mmol/L)作用成骨細h、48h、72h 后，細胞增殖率均有下降，其中較高濃度(2、4、8mmol/L)作用，細胞增殖率也有下降，且與對照組相比差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05)，其中褪濃度為 2mmol/L 作用時間為 24h 時，細胞增殖率明顯下降。

中國醫(yī)科大學博士學位論文3.2 高濃度褪黑素誘導成骨細胞凋亡如圖 2 所示 Annexin V-FITC/PI 雙標染色流式細胞術顯示，當褪黑素作用成骨細胞 24h，濃度達到 2mmol/L 及 2mmol/L 以上時，成骨細胞早期及晚期凋亡明顯增加，并隨褪黑素濃度增大而增加，與對照組相比，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。
【學位授予單位】：中國醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R682.3

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本文編號：2639894