【摘要】：目的:急性閉合性跟腱斷裂往往發(fā)生在腱病(Tendinopathy或Tenositis)的基礎(chǔ)上,將本病者與正常跟腱者的跟腱組織、血清進(jìn)行定量蛋白質(zhì)組學(xué)分析,發(fā)現(xiàn)跟腱傷者與正常跟腱者的跟腱組織、血清有哪些差異蛋白,闡明這些差異蛋白與本病發(fā)生之間的聯(lián)系,從而進(jìn)一步對本病病理基礎(chǔ)給以精確的闡釋,探討本病病因關(guān)鍵靶標(biāo)的作用機(jī)理,同時(shí)為本病提供早期預(yù)警、診斷以及預(yù)后的新方法、新技術(shù)。方法:正常人跟腱組織、血清,急性閉合性跟腱斷裂患者跟腱組織、血清各15例,組內(nèi)樣本隨機(jī)混合成3個(gè)生物學(xué)重復(fù),對跟腱組織和血清進(jìn)行i TRAQ差異蛋白質(zhì)組學(xué)分析,得到的結(jié)果與數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比較,對蛋白進(jìn)行注釋。應(yīng)用生物信息學(xué)軟件對差異表達(dá)的蛋白進(jìn)行GO(Gene ontology)功能分析和KEGG通路分析以本病相關(guān)的目標(biāo)蛋白。并用免疫組化對其中部分差異蛋白進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果:實(shí)驗(yàn)一:1.本次實(shí)驗(yàn)跟腱組織共鑒定到蛋白質(zhì)組(Protein group)2439個(gè),其中符合表達(dá)差異倍數(shù)大于1.2倍(上下調(diào))且P值小于0.05的有410個(gè),其中急性閉合組與正常組比較上調(diào)蛋白共210個(gè),下調(diào)蛋白共200個(gè)。其中載脂蛋白A4(Apolipoprotein A-IV APOA4),整合素β_2(Integrin beta-2 ITGβ_2),假定β-肌動(dòng)蛋白樣蛋白3(Putative beta-actin-like protein3 POTEKP),肌球蛋白調(diào)節(jié)輕鏈2(Myosin regulatory light chain 2 MYL2),纖溶酶原激活物抑制劑-1(Plasminogen activator inhibitor 1 SERPINE1),富含亮氨酸重復(fù)序列和鈣調(diào)理蛋白同源性結(jié)構(gòu)域蛋白4(Leucine-rich repeat and calponin homology domain-containing protein 4 LRCH4),Ⅱ型膠原α-1鏈(Collagen alpha-1(II)chain COL2A1),整合素β_3(Integrin beta-3 ITGβ3),纖維連結(jié)蛋白(Fibronectin FN1)等一系列蛋白參與的信號通路被顯著富集,并且每個(gè)蛋白都參與多個(gè)信號通路,可以做為重點(diǎn)研究對象。在KEGG分析中,對上述組織中410個(gè)差異蛋白經(jīng)過KEGG數(shù)據(jù)庫檢索,共檢索到240個(gè)信號通路。2.血清共鑒定到蛋白質(zhì)組(Protein group)554個(gè),其中符合表達(dá)差異倍數(shù)大于1.2倍(上下調(diào))且P值小于0.05的有44個(gè),其中急性閉合組與正常組比較上調(diào)蛋白共19個(gè),下調(diào)蛋白共25個(gè)。其中載脂蛋白A4(Apolipoprotein A-IV APOA4),丙酮酸激酶(Pyruvate kinase PK),過氧化物酶1(Peroxiredoxin-1 PRDX1),磷酸甘油酸激酶1(Phosphoglycerate kinase 1 PGK1),抑制蛋白-1(Profilin-1 PFN1)等一系列蛋白既是差異蛋白,同時(shí)也是結(jié)點(diǎn)最多的蛋白,后續(xù)可以做為重點(diǎn)研究的對象。對上述血清44個(gè)差異蛋白經(jīng)過KEGG數(shù)據(jù)庫檢索,共檢索到82個(gè)信號通路。實(shí)驗(yàn)二:運(yùn)用免疫組織化學(xué)實(shí)驗(yàn)觀察分析,對15例正常跟腱組和15例急性跟腱斷裂者的跟腱組織標(biāo)本進(jìn)行免疫組化驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。兩組標(biāo)本經(jīng)甲醛固定、石蠟包埋、備切片、脫蠟、水化、內(nèi)源酶清除、再通過高溫高壓抗原修復(fù)、一抗孵育、二抗孵育、還通過DAB顯色和蘇木素復(fù)染,脫水封片等一系列過程。對APOA4、CollagenⅠ、CollagenⅡ、CollagenⅢ等蛋白的顯著差異表達(dá)進(jìn)行檢測觀察。APOA4在正常跟腱組織弱陽性表達(dá),急性跟腱斷裂病理組織中至強(qiáng)陽性表達(dá),APOA4大多呈彌漫失極性表達(dá),呈棕黃色顆粒,位于胞漿內(nèi),部分細(xì)胞出現(xiàn)細(xì)胞核著色。APOA4在正常跟腱組織的陽性表達(dá)率為73.3%,在急性跟腱斷裂者病理組織中的陽性表達(dá)率為93.3%,急性跟腱斷裂者病理組織的表達(dá)強(qiáng)度明顯高于正常組織,與iTRAQ結(jié)果基本一致。?~2值為3.21,P值為0.201,因樣本量少等原因未得到統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。CollagenⅠ,CollagenⅢ在正常跟腱組織中至強(qiáng)陽性表達(dá),急性跟腱斷裂病理組織弱至中陽性表達(dá),大多呈彌漫性表達(dá),呈棕黃色顆粒,位于細(xì)胞漿內(nèi)。CollagenⅠ在正常跟腱組織的陽性表達(dá)率為93.3%,在急性跟腱斷裂者病理組織中的陽性表達(dá)率為86.7%,CollagenⅢ在正常跟腱組織的陽性表達(dá)率為93.3%,以上膠原蛋白在急性跟腱斷裂者病理組織的表達(dá)強(qiáng)度低于正常組織,與iTRAQ結(jié)果基本一致,CollagenⅡ在正常跟腱組織弱至中陽性表達(dá),急性跟腱斷裂病理組織弱至中陽性表達(dá),大多呈彌漫性表達(dá),呈棕黃色顆粒,位于細(xì)胞漿內(nèi)。CollagenⅡ在正常跟腱組織的陽性表達(dá)率為86.7%,在急性跟腱斷裂者病理組織中的陽性表達(dá)率為80.0%,在正常組織與病理組織的表達(dá)強(qiáng)度無明顯差異。CollagenⅠ的?~2值為2.152,P值為0.341,CollagenⅡ的?~2值為0.759,P值為0.684,CollagenⅢ的?~2值為0.733,P值為0.693。因樣本量少、個(gè)體差異等原因未得到統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。結(jié)論:1本研究基于iTRAQ技術(shù)對急性跟腱斷裂傷者組織和血清進(jìn)行蛋白組學(xué)分析,得到了跟腱組織和血清的差異蛋白表達(dá)圖譜,從而為探討急性跟腱斷裂病因列舉了大量實(shí)用的分子生物學(xué)資料。2急性閉合性跟腱斷裂往往發(fā)生在腱病的基礎(chǔ)上,推測APOA4,ITGβ_2,SERPINE1,POTEKP,ITGβ3,FN1,LRCH4,COL2A1,PK,PRDX1,PGK1,FN1等一系列蛋白質(zhì)參與了腱病進(jìn)程,并減低了跟腱的柔韌性,有一定的臨床意義。3運(yùn)用免疫組織化學(xué)實(shí)驗(yàn)觀察分析,對正常跟腱組和急性跟腱斷裂組跟腱組織標(biāo)本進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn),目的蛋白APOA4、CollagenⅠ、CollagenⅡ、CollagenⅢ等生物標(biāo)志物與iTRAQ結(jié)果基本一致,說明在前組織中關(guān)鍵靶標(biāo)穩(wěn)定存在,進(jìn)一步確認(rèn)了蛋白質(zhì)譜實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性。
【圖文】：

生物信息學(xué)分析流程

圖 3 肽段離子得分分步圖（A:組織；B:血清）Fig. 3 the peptide ion score step map(A:Tissue, B:Serum )
【學(xué)位授予單位】：新疆醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R686.1

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本文編號：2628421