【摘要】：背景肝臟移植手術(shù)是肝臟疾病患者病變發(fā)展至終末期,無(wú)法用傳統(tǒng)手術(shù)切除病灶,藥物治療不能控制病情發(fā)展時(shí)的首選治療方法。由于新型免疫抑制劑的廣泛應(yīng)用,發(fā)生在同種異基因的肝移植術(shù)后的排斥反應(yīng)已經(jīng)基本得到解決,受體的存活時(shí)間已經(jīng)得到顯著的改善。但是當(dāng)今肝移植治療所面臨的最大障礙是供體短缺的問(wèn)題。眾所周知,我國(guó)是“肝病大國(guó)”,攜帶乙型肝炎的患者多達(dá)9300萬(wàn)之多,每年因終末期肝臟疾病死亡的患者有30萬(wàn)之多,多數(shù)患者可以通過(guò)肝移植進(jìn)行治療,延長(zhǎng)壽命,但是多數(shù)患者都面臨“無(wú)肝可用”的問(wèn)題,全國(guó)每年實(shí)施的肝移植手術(shù)不足4000例。雖然近些年來(lái)我們大力發(fā)展無(wú)償器官捐贈(zèng),但由于全面禁止死囚器官來(lái)源的規(guī)定出臺(tái)后,供體短缺問(wèn)題依然是阻礙肝移植最大的瓶頸。異種肝移植可以為患者爭(zhēng)取更多時(shí)間等待供肝,甚至有可能完全取代人類(lèi)肝臟,為廣大肝病患者帶來(lái)希望,為解決困擾世界的供肝短缺問(wèn)題提供了徹底解決的方法。但異種移植目前還存在免疫排斥和凝血功能障礙等難題,距離臨床應(yīng)用尚有不小的距離。隨著α-1,3-半乳糖轉(zhuǎn)移酶(α-1,3-galactosyltransferase,α-1,3GT)基因敲除豬(GTKO)的問(wèn)世,異種超急性排斥反應(yīng)(hyperacute rejection,HAR)已得到基本控制,但隨后發(fā)生的急性體液排斥反應(yīng)(Acute humoral xenograft rejection,AHXR)仍是造成異種移植物失活和受體死亡的主要原因。AHXR是一個(gè)多因素多途徑的免疫反應(yīng)過(guò)程,其主要的病理特征是血栓性微血管病或消耗性凝血病如彌漫性血管內(nèi)凝血(Disseminated Intravascular Coagulation,DIC)。目前研究表明供受體的凝血-抗凝血系統(tǒng)不相容所引發(fā)的受體凝血功能紊亂是造成異種移植凝血功能障礙發(fā)生的重要原因�？鼓�-3(Antithrombin-III,AT-III)在豬與靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物之間由于存在種屬差異,不能在人體內(nèi)發(fā)揮有效抗凝作用,致使移植器官血管內(nèi)廣泛產(chǎn)生血栓,最終導(dǎo)致移植失敗。AT-III是血漿中最重要的抗凝物,其由肝臟及血管內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生,在肝素的協(xié)同作用下與FXa和凝血酶結(jié)合發(fā)揮抗凝血作用。本研究擬以豬骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenehymal stem cells,MSCs)為載體,利用慢病毒感染的方法,使豬MSCs表達(dá)人AT-III,并利用體外異種移植凝血模型對(duì)其抗凝效果進(jìn)行檢測(cè),希望為解決異種肝移植術(shù)后受體凝血功能紊亂提供新方案和新思路。目的本實(shí)驗(yàn)利用慢病毒感染技術(shù),將人抗凝血酶III(AT-III)的基因轉(zhuǎn)入GTKO豬源性的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞中,使其表達(dá)并分泌人源性抗凝血酶III,從而減少異種移植中因供受體間凝血調(diào)節(jié)因子不相容引起的凝血紊亂。方法1.提取GTKO小型豬的髂骨骨髓,應(yīng)用反復(fù)貼壁法,將提取細(xì)胞反復(fù)貼壁傳代,到3-6代細(xì)胞進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)其表面標(biāo)記物,并對(duì)GTKO豬源性骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行定向誘導(dǎo)分化,通過(guò)油紅O、茜素紅和Gomori法染色,對(duì)間充質(zhì)干細(xì)胞的分化功能進(jìn)行檢測(cè)。2.構(gòu)建SV40T慢病毒載體,并對(duì)得到的GTKO豬源性的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行感染,達(dá)到間充質(zhì)干細(xì)胞永生化的目的,然后應(yīng)用RT-PCR技術(shù)對(duì)感染后的間充干細(xì)胞SV40T的表達(dá)情況進(jìn)行檢測(cè)。3.構(gòu)建人AT-III基因的慢病毒載體,感染永生化的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞,并用空質(zhì)粒感染間充質(zhì)干細(xì)胞作為對(duì)照組,應(yīng)用免疫熒光技術(shù)、RT-PCR技術(shù)和Western blot技術(shù),對(duì)轉(zhuǎn)染后間充質(zhì)干細(xì)胞人AT-III的m RNA和蛋白表達(dá)情況進(jìn)行檢測(cè)。4.將人血清、豬內(nèi)皮細(xì)胞和GTKO小型豬的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行共培養(yǎng),構(gòu)建異種移植凝血障礙體外模型,轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒MSC作為空轉(zhuǎn)染組、轉(zhuǎn)染h AT-ⅢMSC為轉(zhuǎn)染組,加入重組h AT-Ⅲ蛋白為重組h AT-Ⅲ組和經(jīng)鼠抗h AT-Ⅲ阻斷性抗體處理的轉(zhuǎn)染h AT-ⅢMSC為抗h AT-Ⅲ組,應(yīng)用ELISA技術(shù)檢測(cè)共培養(yǎng)體系中凝血酶-抗凝血酶復(fù)合物的含量,應(yīng)用復(fù)鈣實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各實(shí)驗(yàn)組的凝集時(shí)間。結(jié)果1.反復(fù)離心、貼壁,不斷純化間充質(zhì)干細(xì)胞,在第3代得到GTKO豬源性骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞,應(yīng)用流式細(xì)胞技術(shù)對(duì)其表面標(biāo)記物進(jìn)行檢測(cè),檢測(cè)結(jié)果提示造血細(xì)胞的表面標(biāo)記物CD34、CD45低表達(dá),高表達(dá)干細(xì)胞表面標(biāo)記物CD29、CD90、CD105。進(jìn)行成脂、成骨定向分化誘導(dǎo),并對(duì)誘導(dǎo)的細(xì)胞分別進(jìn)行特異性染色,油紅O染色看到細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)紅染的脂滴,Gomori法染色可以看到胞質(zhì)內(nèi)鈣結(jié)節(jié)的黑色顆粒,茜素紅染色可以看到紅染的鈣結(jié)節(jié)。提示骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化能力良好,具有干細(xì)胞特性。2.構(gòu)建SV40T的慢病毒載體,測(cè)得病毒滴度為5×108TU/ml,對(duì)得到的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行感染,感染后應(yīng)用RT-PCR測(cè)定SV40T的m RNA表達(dá),實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示成功導(dǎo)入SV40T抗原基因。3.通過(guò)慢病毒感染人AT-III基因后進(jìn)行免疫熒光染色、RT-PCR和Western bolt對(duì)轉(zhuǎn)入的人AT-III進(jìn)行檢測(cè),結(jié)果提示成功導(dǎo)入目的基因。4.AT-III AT-III組凝集時(shí)間延長(zhǎng),出現(xiàn)纖維蛋白絲的時(shí)間較對(duì)照組長(zhǎng);應(yīng)用凝血結(jié)合實(shí)驗(yàn)ELISA法檢測(cè)體系中凝血酶-抗凝血酶復(fù)合物的含量,結(jié)果提示轉(zhuǎn)染組中凝血酶-抗凝血酶含量較對(duì)照組高,轉(zhuǎn)染組中分泌的人AT-III可以有效結(jié)合凝血酶,抑制其發(fā)揮促凝血的作用。結(jié)論成功提取GTKO小型豬源性的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞,并使其永生化建立細(xì)胞系,成功轉(zhuǎn)入人AT-III基因,并且表達(dá)良好,經(jīng)過(guò)轉(zhuǎn)入人AT-III基因的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在異種移植凝血障礙體外模型中可以有效地抑制凝血紊亂的發(fā)生。
【圖文】：

圖 1 GTKO 豬源性骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的鑒定。A:光鏡下骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的形態(tài)（×100）；B:骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞表面標(biāo)記物的流式圖；C:成脂誘導(dǎo)油紅染色（×200）；成骨誘導(dǎo) Gomori法 ALP 染色（×200）；成骨誘導(dǎo)茜素紅 ALP 染色。4 討論間充質(zhì)干細(xì)胞具有低免疫原性，多向分化性。國(guó)內(nèi)外報(bào)道多例間充質(zhì)干細(xì)胞用于細(xì)胞治療，例如王建偉等[106]在豚鼠-大鼠的原位異種移植手術(shù)前，將間充質(zhì)干細(xì)胞輸入受體體內(nèi)，可以明顯干預(yù)異種移植的排斥反應(yīng)，可以使移植物存活更長(zhǎng)時(shí)間。本實(shí)驗(yàn)采用大動(dòng)物豬源性的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，取自 GTKO 小型豬的髂骨，并應(yīng)用反復(fù)貼壁法來(lái)獲得骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞。通過(guò)比較，骨髓穿刺法提取骨髓雖然獲得的間充質(zhì)干細(xì)胞較少，但保證實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的存活的情況下可以進(jìn)行反復(fù)的提取，并可以將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物用于后續(xù)的大動(dòng)物動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，避免了資金的浪費(fèi)。

圖 2 感染 SV40T 基因后 293T 細(xì)胞 SV40T 的表達(dá)微鏡下觀察 SV40T 感染后 293T 細(xì)胞后的熒光激發(fā)情況，，圖野均為特異性熒光，而 7 號(hào)空中特異性熒光較少。如圖 3T 轉(zhuǎn)染后 293T 細(xì)胞病毒滴度 A：1 號(hào)孔 慢病毒液 10×10-3mL B毒液 10×10-8mL（IF×100）
【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類(lèi)號(hào)】：R657.3

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前2條

1 夏強(qiáng);;突破肝移植的瓶頸階段[J];肝膽外科雜志;2010年03期

2 姚丹華;李幼生;黎介壽;;異種移植的研究進(jìn)展[J];中國(guó)普外基礎(chǔ)與臨床雜志;2013年12期

本文編號(hào)：2571050