發(fā)布時(shí)間：2019-11-11 22:32

【摘要】：【研究背景及目的】終末期肝病的治療一般為肝臟器官移植,然而目前存在供肝不足、或者患者等不到肝源而死亡等現(xiàn)象。肝細(xì)胞移植是一種替代治療方法,是指將肝細(xì)胞通過(guò)各種手段移植入病人體中,代替受損肝臟發(fā)揮作用。肝細(xì)胞移植術(shù)發(fā)展很早,距今已有30多年的歷史,然而目前存在移植細(xì)胞體內(nèi)增殖困難等問(wèn)題導(dǎo)致其發(fā)展不前。我們?cè)谘芯扛卧偕Ｐ彤?dāng)中發(fā)現(xiàn),肝細(xì)胞體內(nèi)實(shí)現(xiàn)再生的過(guò)程實(shí)際上是由肝細(xì)胞與周圍環(huán)境共同作用的結(jié)果。在肝再生領(lǐng)域,由于其面臨的瓶頸在于原代肝細(xì)胞來(lái)源的缺乏以及不能在體外實(shí)現(xiàn)大規(guī)模增殖,大部分的研究者將重心放在實(shí)現(xiàn)治療細(xì)胞的體外擴(kuò)增和肝功能的表達(dá)上,研究方法包括將體內(nèi)各類細(xì)胞在體外經(jīng)定向分化轉(zhuǎn)變?yōu)楣δ芨渭?xì)胞,如體細(xì)胞誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(i PSC),胚胎干細(xì)胞(ESC),間充質(zhì)干細(xì)胞(MSC)等等,以及轉(zhuǎn)錄因子誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)分化為肝細(xì)胞。這些細(xì)胞通過(guò)特定基因的過(guò)表達(dá)和培養(yǎng)刺激可實(shí)現(xiàn)體外大規(guī)模的擴(kuò)增,同時(shí)經(jīng)過(guò)定向分化在體外具備一定的肝功能,但是總的來(lái)說(shuō),這些細(xì)胞在體外的肝功能表達(dá)并不是十分完善和穩(wěn)定,體內(nèi)的重建效率也非常低,不能達(dá)到治療的目的。另外經(jīng)過(guò)病毒感染和基因重組的細(xì)胞應(yīng)用于臨床也存在很高的安全風(fēng)險(xiǎn)。因此我們一直嘗試采用小分子化合物來(lái)誘導(dǎo)原代肝細(xì)胞的轉(zhuǎn)分化,經(jīng)過(guò)長(zhǎng)時(shí)間探究和篩選,最終我們確定一系列小分子化合物的組合形式,成功實(shí)現(xiàn)了小鼠原代肝細(xì)胞在體外的持續(xù)增殖。增殖的細(xì)胞命名為hep PDCS,具備肝祖細(xì)胞的特性,而在小分子化合物的誘導(dǎo)下,又可以停止增殖重新分化為有典型肝功能的肝細(xì)胞hep PDCS-hep。相較于其他方法誘導(dǎo)來(lái)源的功能肝細(xì)胞,這類細(xì)胞沒有經(jīng)過(guò)病毒感染,基因組未插入任何片段,確保了肝細(xì)胞移植的安全性。除此之外,最具意義的是,hep PDCS-hep進(jìn)行移植后最高的替代率可達(dá)到70%以上,具有良好的醫(yī)療運(yùn)用前景。與此同時(shí),我們還探究了肝臟損傷微環(huán)境對(duì)肝細(xì)胞移植的影響。肝臟微環(huán)境主要由肝臟中的巨噬細(xì)胞(Kupffer cells)、竇狀內(nèi)皮細(xì)胞、星狀細(xì)胞等非實(shí)質(zhì)細(xì)胞及其分泌的各類細(xì)胞基質(zhì)和細(xì)胞因子構(gòu)成。其中Kupffer細(xì)胞數(shù)量占肝細(xì)胞總體數(shù)量的15%,具備非常多的生物學(xué)功能:抗原提呈;吞噬作用;參與肝臟代謝;參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展及促進(jìn)肝再生等。激活后的Kupffer細(xì)胞分泌大量細(xì)胞因子:TNF、TGF-B、IL-1、IL-6等等,其中TNF-A和IL-6啟動(dòng)了肝臟的再生以及肝干細(xì)胞的活化和增殖過(guò)程,使肝細(xì)胞由G0期到G1期并通過(guò)限制點(diǎn)進(jìn)入S期,完成有絲分裂。后續(xù)的研究中發(fā)現(xiàn)Kupffer細(xì)胞分泌的IL-17也可以啟動(dòng)肝臟再生。有研究人員在肝切的模型中證明清除Kupffer細(xì)胞后會(huì)延遲肝再生的過(guò)程,也有人證明清除Kupffer細(xì)胞后加速肝再生的過(guò)程。然而沒有研究深入探討Kupffer細(xì)胞是否對(duì)肝細(xì)胞移植有所影響。我們通過(guò)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),巨噬細(xì)胞可影響Fah再生模型中細(xì)胞定植和增殖的過(guò)程。綜上所述,本研究通過(guò)獲得在體內(nèi)外兼具備良好功能的肝細(xì)胞以及研究肝再生過(guò)程中肝臟微環(huán)境的變化,找到了可能提高移植效率的方法,從而為臨床的移植細(xì)胞來(lái)源與方式提供新的策略和參考�！緦�(shí)驗(yàn)方法】1.小分子化合物的篩選及組合通過(guò)CK19-Cre ERT/R26GFP小鼠的基因報(bào)告系統(tǒng)來(lái)確定。2.采用免疫熒光,流式細(xì)胞術(shù),芯片分析,PCR等檢測(cè)手段驗(yàn)證肝細(xì)胞體外的膽管化增殖;通過(guò)細(xì)胞計(jì)數(shù),倍增時(shí)間,核型分析等方法確定肝細(xì)胞能否在體外進(jìn)行基因型穩(wěn)定的大規(guī)模擴(kuò)增。3.為了進(jìn)一步驗(yàn)證體外增殖的細(xì)胞無(wú)體內(nèi)膽管化細(xì)胞以及其他非實(shí)質(zhì)細(xì)胞的污染,將R26YFP小鼠經(jīng)尾靜脈注射AAV8-TBG-Cre病毒,1周以后分離原代肝細(xì)胞進(jìn)行流式分選,分選自帶GFP熒光的肝細(xì)胞后進(jìn)行貼壁培養(yǎng)。4.將肝細(xì)胞進(jìn)行肝系和膽系的定向分化后,通過(guò)免疫熒光,芯片分析,羅丹寧,藥物代謝,El ISA等實(shí)驗(yàn)確定體外增殖的肝細(xì)胞是否具有雙向分化的潛能。5.將肝系分化的成熟肝細(xì)胞移植入Fah基因缺陷的小鼠體內(nèi),在2個(gè)月后通過(guò)免疫組化,生化檢測(cè)驗(yàn)證其移植的效率以及對(duì)小鼠肝功能,生存率的影響。6.將維持Fah基因缺陷小鼠生存的藥物NTBC撤除后,通過(guò)免疫組化在不同的時(shí)間點(diǎn)觀察巨噬細(xì)胞的變化。7.采用脂質(zhì)體將Fah基因缺陷小鼠體內(nèi)的巨噬細(xì)胞清除后,移植原代肝細(xì)胞,比較在不同時(shí)間點(diǎn)肝細(xì)胞重建肝臟的比例。8.分離Fah基因缺陷小鼠骨髓單核細(xì)胞,采用GM-CSF細(xì)胞因子刺激單核細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)榫奘杉?xì)胞,經(jīng)培養(yǎng)與鑒定后,將純化的巨噬細(xì)胞與原代肝細(xì)胞按一定比例混合回輸入撤藥后的Fah基因缺陷小鼠肝臟內(nèi),觀察在此條件下肝細(xì)胞重建的效率是否受到影響.【實(shí)驗(yàn)結(jié)果】1、在特定培養(yǎng)條件刺激下,肝細(xì)胞可以進(jìn)行長(zhǎng)時(shí)間的膽管化增殖。2、通過(guò)CK19-Cre ERT/R26GFP小鼠與注射AAV8-TBG-Cre病毒的R26YFP小鼠證明成熟肝細(xì)胞可以在體外膽管化增殖。3、hep PDCS具有肝前體細(xì)胞的特征:經(jīng)過(guò)肝系分化的肝細(xì)胞具有成熟肝細(xì)胞的特性,表達(dá)肝特異性基因,具有分泌白蛋白,藥物代謝,尿素合成,存儲(chǔ)糖原等功能;在三維培養(yǎng)中可形成具有功能的膽小管結(jié)構(gòu)。4、分化成熟的肝細(xì)胞回輸入Fah基因缺陷小鼠肝臟后,能緩解肝損傷,顯著提高小鼠生存率,最高的整合效率可達(dá)90%以上。5、Fah基因缺陷小鼠在NTBC撤除后,隨之時(shí)間的延長(zhǎng)伴隨著巨噬細(xì)胞的活化。6、清除巨噬細(xì)胞后有利于提高肝細(xì)胞移植的重建效率。7、巨噬細(xì)胞與肝細(xì)胞共同移植回輸入Fah基因缺陷小鼠的體內(nèi)后,小鼠的肝損傷加重,肝臟重建效率降低�！窘Y(jié)論】本研究通過(guò)小分子化合物的誘導(dǎo),成功地實(shí)現(xiàn)了原代肝細(xì)胞在體外的膽管化增殖。這種形式增殖的細(xì)胞沒有經(jīng)過(guò)病毒感染,基因組未插入任何片段,確保了肝細(xì)胞移植的安全性。此外,細(xì)胞在定向分化后具有成熟肝細(xì)胞的功能,并且可以大面積地整合到Fah基因缺陷小鼠的體內(nèi),提高小鼠的生存率,為臨床肝細(xì)胞移植提供新型的細(xì)胞來(lái)源;同時(shí),在Fah基因缺陷小鼠的模型中,我們還發(fā)現(xiàn)肝損傷的過(guò)程中伴隨著巨噬細(xì)胞的活化,清除巨噬細(xì)胞后肝細(xì)胞移植的效率提高,這提示我們,移植的肝細(xì)胞在體內(nèi)能夠增殖不僅取決于細(xì)胞本身的功能,肝臟微環(huán)境對(duì)于移植細(xì)胞的整合也是一個(gè)很重要的影響因素。
【圖文】：

及肝前體細(xì)胞(LPC)。為了排除其他膽管樣細(xì)胞的污染，我們采用 percoll 密度離心的方法再次純化 GFP 陰性的肝細(xì)胞，用 BEC 表面標(biāo)志 CK19 和 Epcam 對(duì) GFP 陰性的肝細(xì)胞再次進(jìn)行流式鑒定，如圖1-C所示，GFP陰性的細(xì)胞不表達(dá)CK19和Epcam，之后將 GFP 陰性的細(xì)胞進(jìn)行體外培養(yǎng),我們發(fā)現(xiàn),當(dāng)在添加生長(zhǎng)因子 EGF 和 HGF 的傳統(tǒng)肝細(xì)胞培養(yǎng)基（HGM）中生長(zhǎng)時(shí)，原本不表達(dá) CK19 的肝細(xì)胞在生長(zhǎng)至第七天時(shí)表達(dá) Ck19，加入 4-OH-tamoxifen 后，肝細(xì)胞會(huì)表達(dá) GFP（圖 1-D)，在此過(guò)程中，肝系基因(Alb, G6pc 和 Hnf4α）表達(dá)逐漸減弱，膽系基因（CK7, CK19 和 Sox9）逐漸增強(qiáng)（圖 1-H）,也就是說(shuō)小分子化合物的添加可以使肝細(xì)胞在體外開始發(fā)生膽管化。因此我們采用 CK19-CreERT/R26GFP小鼠肝細(xì)胞的這套報(bào)告系統(tǒng)

圖 2：成熟肝細(xì)胞可以在體外膽管化增殖A:AAV8-TBG-Cre 病毒感染 R26YFP 小鼠后，分選原代肝細(xì)胞及體外培B: 流式檢測(cè)原代肝細(xì)胞 YFP 陽(yáng)性的百分率； C:YFP 陽(yáng)性細(xì)胞Epcam 流式鑒定圖； D：YFP 陽(yáng)性細(xì)胞體外培養(yǎng) 0 天和 7 天時(shí)明場(chǎng)形態(tài)FP 情況，bar=50um； E：TEM 培養(yǎng) 5 天后，肝細(xì)胞表面標(biāo)記 CK19 的 F：YFP 陽(yáng)性細(xì)胞在培養(yǎng) 0 天和第 7 天表達(dá) CK19 和 Alb 的免疫熒光記為綠色，CK19 和 Alb 分別標(biāo)記為紅色，DAPI 標(biāo)記為藍(lán)色，bar=10三、hepPDCS 具有肝前體細(xì)胞的特征了進(jìn)一步探究 hepPDCS 的特性，我們將 hepPDCS，原代肝細(xì)胞（PH管上皮細(xì)胞（BEC），育齡 13.5 天的胎肝細(xì)胞（E13.5）,表達(dá) Foxl1 的細(xì)胞（LPC）進(jìn)行了全基因組芯片測(cè)序,比較發(fā)現(xiàn),hepPDCS 的基因譜更細(xì)胞及胎肝細(xì)胞，，而與 BEC 和 LPC 相距較遠(yuǎn)（圖 3-B），這說(shuō)明盡管 hep膽管化進(jìn)行增殖，它還是來(lái)源于肝細(xì)胞。而通過(guò)基因表達(dá)半定量分析發(fā)
【學(xué)位授予單位】：第二軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R657.3

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前2條

1 Giada Pietrosi;Giovanni Battista Vizzini;Salvatore Gruttadauria;Bruno Gridelli;;Clinical applications of hepatocyte transplantation[J];World Journal of Gastroenterology;2009年17期

2 Philippe A Lysy;David Campard;Fran oise Smets;Mustapha Najimi;Etienne M Sokal;;Stem cells for liver tissue repair:Current knowledge and perspectives[J];World Journal of Gastroenterology;2008年06期

本文編號(hào)：2559455