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肝細胞移植新型細胞來源及提高肝細胞移植效率的研究

發(fā)布時間:2019-11-11 22:32
【摘要】:【研究背景及目的】終末期肝病的治療一般為肝臟器官移植,然而目前存在供肝不足、或者患者等不到肝源而死亡等現(xiàn)象。肝細胞移植是一種替代治療方法,是指將肝細胞通過各種手段移植入病人體中,代替受損肝臟發(fā)揮作用。肝細胞移植術(shù)發(fā)展很早,距今已有30多年的歷史,然而目前存在移植細胞體內(nèi)增殖困難等問題導(dǎo)致其發(fā)展不前。我們在研究肝再生模型當中發(fā)現(xiàn),肝細胞體內(nèi)實現(xiàn)再生的過程實際上是由肝細胞與周圍環(huán)境共同作用的結(jié)果。在肝再生領(lǐng)域,由于其面臨的瓶頸在于原代肝細胞來源的缺乏以及不能在體外實現(xiàn)大規(guī)模增殖,大部分的研究者將重心放在實現(xiàn)治療細胞的體外擴增和肝功能的表達上,研究方法包括將體內(nèi)各類細胞在體外經(jīng)定向分化轉(zhuǎn)變?yōu)楣δ芨渭毎?如體細胞誘導(dǎo)多能干細胞(i PSC),胚胎干細胞(ESC),間充質(zhì)干細胞(MSC)等等,以及轉(zhuǎn)錄因子誘導(dǎo)成纖維細胞轉(zhuǎn)分化為肝細胞。這些細胞通過特定基因的過表達和培養(yǎng)刺激可實現(xiàn)體外大規(guī)模的擴增,同時經(jīng)過定向分化在體外具備一定的肝功能,但是總的來說,這些細胞在體外的肝功能表達并不是十分完善和穩(wěn)定,體內(nèi)的重建效率也非常低,不能達到治療的目的。另外經(jīng)過病毒感染和基因重組的細胞應(yīng)用于臨床也存在很高的安全風險。因此我們一直嘗試采用小分子化合物來誘導(dǎo)原代肝細胞的轉(zhuǎn)分化,經(jīng)過長時間探究和篩選,最終我們確定一系列小分子化合物的組合形式,成功實現(xiàn)了小鼠原代肝細胞在體外的持續(xù)增殖。增殖的細胞命名為hep PDCS,具備肝祖細胞的特性,而在小分子化合物的誘導(dǎo)下,又可以停止增殖重新分化為有典型肝功能的肝細胞hep PDCS-hep。相較于其他方法誘導(dǎo)來源的功能肝細胞,這類細胞沒有經(jīng)過病毒感染,基因組未插入任何片段,確保了肝細胞移植的安全性。除此之外,最具意義的是,hep PDCS-hep進行移植后最高的替代率可達到70%以上,具有良好的醫(yī)療運用前景。與此同時,我們還探究了肝臟損傷微環(huán)境對肝細胞移植的影響。肝臟微環(huán)境主要由肝臟中的巨噬細胞(Kupffer cells)、竇狀內(nèi)皮細胞、星狀細胞等非實質(zhì)細胞及其分泌的各類細胞基質(zhì)和細胞因子構(gòu)成。其中Kupffer細胞數(shù)量占肝細胞總體數(shù)量的15%,具備非常多的生物學(xué)功能:抗原提呈;吞噬作用;參與肝臟代謝;參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展及促進肝再生等。激活后的Kupffer細胞分泌大量細胞因子:TNF、TGF-B、IL-1、IL-6等等,其中TNF-A和IL-6啟動了肝臟的再生以及肝干細胞的活化和增殖過程,使肝細胞由G0期到G1期并通過限制點進入S期,完成有絲分裂。后續(xù)的研究中發(fā)現(xiàn)Kupffer細胞分泌的IL-17也可以啟動肝臟再生。有研究人員在肝切的模型中證明清除Kupffer細胞后會延遲肝再生的過程,也有人證明清除Kupffer細胞后加速肝再生的過程。然而沒有研究深入探討Kupffer細胞是否對肝細胞移植有所影響。我們通過實驗發(fā)現(xiàn),巨噬細胞可影響Fah再生模型中細胞定植和增殖的過程。綜上所述,本研究通過獲得在體內(nèi)外兼具備良好功能的肝細胞以及研究肝再生過程中肝臟微環(huán)境的變化,找到了可能提高移植效率的方法,從而為臨床的移植細胞來源與方式提供新的策略和參考。【實驗方法】1.小分子化合物的篩選及組合通過CK19-Cre ERT/R26GFP小鼠的基因報告系統(tǒng)來確定。2.采用免疫熒光,流式細胞術(shù),芯片分析,PCR等檢測手段驗證肝細胞體外的膽管化增殖;通過細胞計數(shù),倍增時間,核型分析等方法確定肝細胞能否在體外進行基因型穩(wěn)定的大規(guī)模擴增。3.為了進一步驗證體外增殖的細胞無體內(nèi)膽管化細胞以及其他非實質(zhì)細胞的污染,將R26YFP小鼠經(jīng)尾靜脈注射AAV8-TBG-Cre病毒,1周以后分離原代肝細胞進行流式分選,分選自帶GFP熒光的肝細胞后進行貼壁培養(yǎng)。4.將肝細胞進行肝系和膽系的定向分化后,通過免疫熒光,芯片分析,羅丹寧,藥物代謝,El ISA等實驗確定體外增殖的肝細胞是否具有雙向分化的潛能。5.將肝系分化的成熟肝細胞移植入Fah基因缺陷的小鼠體內(nèi),在2個月后通過免疫組化,生化檢測驗證其移植的效率以及對小鼠肝功能,生存率的影響。6.將維持Fah基因缺陷小鼠生存的藥物NTBC撤除后,通過免疫組化在不同的時間點觀察巨噬細胞的變化。7.采用脂質(zhì)體將Fah基因缺陷小鼠體內(nèi)的巨噬細胞清除后,移植原代肝細胞,比較在不同時間點肝細胞重建肝臟的比例。8.分離Fah基因缺陷小鼠骨髓單核細胞,采用GM-CSF細胞因子刺激單核細胞轉(zhuǎn)變?yōu)榫奘杉毎?經(jīng)培養(yǎng)與鑒定后,將純化的巨噬細胞與原代肝細胞按一定比例混合回輸入撤藥后的Fah基因缺陷小鼠肝臟內(nèi),觀察在此條件下肝細胞重建的效率是否受到影響.【實驗結(jié)果】1、在特定培養(yǎng)條件刺激下,肝細胞可以進行長時間的膽管化增殖。2、通過CK19-Cre ERT/R26GFP小鼠與注射AAV8-TBG-Cre病毒的R26YFP小鼠證明成熟肝細胞可以在體外膽管化增殖。3、hep PDCS具有肝前體細胞的特征:經(jīng)過肝系分化的肝細胞具有成熟肝細胞的特性,表達肝特異性基因,具有分泌白蛋白,藥物代謝,尿素合成,存儲糖原等功能;在三維培養(yǎng)中可形成具有功能的膽小管結(jié)構(gòu)。4、分化成熟的肝細胞回輸入Fah基因缺陷小鼠肝臟后,能緩解肝損傷,顯著提高小鼠生存率,最高的整合效率可達90%以上。5、Fah基因缺陷小鼠在NTBC撤除后,隨之時間的延長伴隨著巨噬細胞的活化。6、清除巨噬細胞后有利于提高肝細胞移植的重建效率。7、巨噬細胞與肝細胞共同移植回輸入Fah基因缺陷小鼠的體內(nèi)后,小鼠的肝損傷加重,肝臟重建效率降低。【結(jié)論】本研究通過小分子化合物的誘導(dǎo),成功地實現(xiàn)了原代肝細胞在體外的膽管化增殖。這種形式增殖的細胞沒有經(jīng)過病毒感染,基因組未插入任何片段,確保了肝細胞移植的安全性。此外,細胞在定向分化后具有成熟肝細胞的功能,并且可以大面積地整合到Fah基因缺陷小鼠的體內(nèi),提高小鼠的生存率,為臨床肝細胞移植提供新型的細胞來源;同時,在Fah基因缺陷小鼠的模型中,我們還發(fā)現(xiàn)肝損傷的過程中伴隨著巨噬細胞的活化,清除巨噬細胞后肝細胞移植的效率提高,這提示我們,移植的肝細胞在體內(nèi)能夠增殖不僅取決于細胞本身的功能,肝臟微環(huán)境對于移植細胞的整合也是一個很重要的影響因素。
【圖文】:

肝細胞,膽管,培養(yǎng)條件


及肝前體細胞(LPC)。為了排除其他膽管樣細胞的污染,我們采用 percoll 密度離心的方法再次純化 GFP 陰性的肝細胞,用 BEC 表面標志 CK19 和 Epcam 對 GFP 陰性的肝細胞再次進行流式鑒定,如圖1-C所示,GFP陰性的細胞不表達CK19和Epcam,之后將 GFP 陰性的細胞進行體外培養(yǎng),我們發(fā)現(xiàn),當在添加生長因子 EGF 和 HGF 的傳統(tǒng)肝細胞培養(yǎng)基(HGM)中生長時,原本不表達 CK19 的肝細胞在生長至第七天時表達 Ck19,加入 4-OH-tamoxifen 后,肝細胞會表達 GFP(圖 1-D),在此過程中,肝系基因(Alb, G6pc 和 Hnf4α)表達逐漸減弱,膽系基因(CK7, CK19 和 Sox9)逐漸增強(圖 1-H),也就是說小分子化合物的添加可以使肝細胞在體外開始發(fā)生膽管化。因此我們采用 CK19-CreERT/R26GFP小鼠肝細胞的這套報告系統(tǒng)

流式,膽管,病毒感染,體外培養(yǎng)


圖 2:成熟肝細胞可以在體外膽管化增殖A:AAV8-TBG-Cre 病毒感染 R26YFP 小鼠后,分選原代肝細胞及體外培B: 流式檢測原代肝細胞 YFP 陽性的百分率; C:YFP 陽性細胞Epcam 流式鑒定圖; D:YFP 陽性細胞體外培養(yǎng) 0 天和 7 天時明場形態(tài)FP 情況,bar=50um; E:TEM 培養(yǎng) 5 天后,肝細胞表面標記 CK19 的 F:YFP 陽性細胞在培養(yǎng) 0 天和第 7 天表達 CK19 和 Alb 的免疫熒光記為綠色,CK19 和 Alb 分別標記為紅色,DAPI 標記為藍色,bar=10三、hepPDCS 具有肝前體細胞的特征了進一步探究 hepPDCS 的特性,我們將 hepPDCS,原代肝細胞(PH管上皮細胞(BEC),育齡 13.5 天的胎肝細胞(E13.5),表達 Foxl1 的細胞(LPC)進行了全基因組芯片測序,比較發(fā)現(xiàn),hepPDCS 的基因譜更細胞及胎肝細胞,,而與 BEC 和 LPC 相距較遠(圖 3-B),這說明盡管 hep膽管化進行增殖,它還是來源于肝細胞。而通過基因表達半定量分析發(fā)
【學(xué)位授予單位】:第二軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】:碩士
【學(xué)位授予年份】:2017
【分類號】:R657.3

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前2條

1 Giada Pietrosi;Giovanni Battista Vizzini;Salvatore Gruttadauria;Bruno Gridelli;;Clinical applications of hepatocyte transplantation[J];World Journal of Gastroenterology;2009年17期

2 Philippe A Lysy;David Campard;Fran oise Smets;Mustapha Najimi;Etienne M Sokal;;Stem cells for liver tissue repair:Current knowledge and perspectives[J];World Journal of Gastroenterology;2008年06期



本文編號:2559455

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