【摘要】：背景:椎間盤退行性疾病(disc degenerative disease,DDD)是一類以椎間盤(intervertebral disc,IVD)髓核(nucleus pulposus,NP)退變?yōu)楹诵牟±碜兓�、以NP碎裂、IVD突出為主要病理結果,進而引起一系列臨床癥狀的脊柱疾患,其人群發(fā)病率極高,嚴重影響中老年人的勞動能力和生活質量,已成為日益突出的社會健康問題。目前,針對DDD的治療均以緩解和改善臨床癥狀為目的,尚無修復退變碎裂的NP、重建IVD的生物力學功能的臨床治療手段。組織工程技術的發(fā)展為NP的再生修復展現(xiàn)出嶄新的前景,日益受到廣泛關注。目的:IVD在體內(nèi)主要是發(fā)揮生物力學功能,承載著較高的應力負荷,其中NP更是承載了脊柱所受到的70%軸向應力負荷。因此組織工程髓核(tissue-engineered nucleus pulposus,TE-NP)在植入體內(nèi)時應具有良好的力學性能和生物學功能,保證在較高的應力負荷下TE-NP可以維持其結構和功能,為NP組織提供再生模板,恢復IVD的生物力學功能,重建脊柱的生物力學。然而,目前TE-NP的生物力學性能的不足是限制TE-NP進一步發(fā)展的重要瓶頸問題之一。本研究旨在構建一種具有較強力學性能和生物活性的TE-NP,然后在此基礎之上,研究不同強度軸向壓應力對TE-NP內(nèi)髓核細胞(NPCs)生物學功能的影響。方法:本課題在前期研究的基礎之上,制備了一種由天然材料——氧化葡聚糖(oxidative dextran,ODex)、氨基化明膠(amino gelatin,MGel)以及合成材料——四臂聚乙二醇-丙烯酸酯(4-arm-poly-(ethylene glycol)-acrylate,4A-PEG-Acr)構成的、適用于NP修復的強化力學性能多層互穿多聚物網(wǎng)絡(interpenetrating polymer network,IPN)水凝膠。本研究通過調(diào)整IPN水凝膠中4A-PEG-Acr的比例,檢測孔徑、孔隙率、力學性能、水合能力以及細胞相容性等理化性能,以優(yōu)化篩選適用于TE-NP的性能最優(yōu)的、仿生的IPN水凝膠,然后觀察該IPN水凝膠內(nèi)三維(three dimensional,3D)培養(yǎng)的NPCs增殖活性、生化成分含量、NP特異性基因和胞外基質(extracellular matrix,ECM)相關蛋白的表達。在此基礎之上,將TE-NP置入前期自主研發(fā)的 智能化反饋調(diào)控組織軸向應力仿生施加及培養(yǎng)系統(tǒng)‖中,運用不同強度的動態(tài)軸向壓應力加載于TE-NP以增強其生物學功能,觀察不同強度的壓應力對TE-NP的細胞增殖活性、ECM合成、細胞表型、合成代謝、分解代謝、炎癥相關基因表達、細胞凋亡及細胞骨架的影響,探索軸向壓應力對TE-NP生物學功能的效應 窗‖,尋找對TE-NP生物學功能發(fā)揮正向調(diào)控作用的軸向壓應力的適宜強度。結果:(1)由4A-PEG-acr、ODex和MGel通過兩步交聯(lián)反應制成的IPN水凝膠是適用于NP組織工程的良好支架材料。當三者的成分比例為2:3:5時,該水凝膠具有仿生的3D結構、高孔徑、高強度、高韌性、與NP類似的吸水膨脹能力以及良好的細胞相容性。接種于該水凝膠中的NPCs具有良好的增殖活力,并維持了天然的表型,具有良好的生物合成能力。(2)不同強度的軸向壓應力對TE-NP的生物學功能產(chǎn)生了不同的影響。根據(jù)本研究發(fā)現(xiàn),低強度的壓應力(1%~10%)尤其是壓縮量為1%的壓應力可以有效地增強TE-NP的細胞增殖活性和合成代謝能力,減少了NPCs的分解代謝、炎癥相關基因表達和凋亡,并維持細胞正常的類圓形結構;而高強度的壓應力(15%-20%)對TE-NP的生物學功能起到了負性調(diào)節(jié)作用,導致了NPCs的分解代謝、炎癥相關基因和凋亡相關基因表達的上調(diào),合成代謝減少,波形蛋白的表達升高且細胞形態(tài)呈長梭形改變。全文結論:由4A-PEG-acr、ODex和MGel通過兩步交聯(lián)反應制成的IPN水凝膠是適用于NP組織工程的良好支架材料,當三者的成分比例為2:3:5時該水凝膠具有強化的力學性能和良好的細胞相容性,有利于承載一定強度的應力負荷。以該水凝膠為支架構建的TE-NP在低強度的應力作用(1-10%)尤其是壓縮量為1%的低強度壓應力作用下,細胞維持了天然的類圓形結構,內(nèi)部細胞增殖活性和合成代謝能力明顯增強,進一步增強了TE-NP的生物活性;然而,高強度的壓應力作用(15%-20%)對TE-NP的生物學功能起到了負性調(diào)節(jié)的作用。本研究制備具有良好的力學性能和生物活性的TE-NP,并發(fā)現(xiàn)低強度壓應力可以增強TE-NP的生物學功能,為其臨床應用奠定了實驗基礎和提供了理論依據(jù)。
【圖文】：

取 5 g 的四臂 PEG 置入除去水的二氯甲烷中，蒸餾，待冷卻后，向反應體系中加入 1115 ul 的三乙胺并充分攪拌混勻。隨后，向反應體系中充入氮氣，保證體系處于無O2的狀態(tài)，將 325 ul 丙烯酸酯加入溶液中，避光反應，用恒溫磁力攪拌器在 37℃下攪拌反應 24 h。反應結束后，抽濾二氯甲烷，加入無水乙醚沉淀三次后，將白色固體產(chǎn)物溶于雙蒸水。將溶液轉移至預處理過的透析袋（MWCO1000）中，放入大體積的雙蒸水中進行透析，每天換水 4 次，共透析 4 天。將透析產(chǎn)物在超低溫冰箱中預凍后置于冷凍干燥機中凍干。稱重，置于真空干燥器保存。2.2.4.5 IPN 水凝膠的合成使用兩步反應法合成 IPN 水凝膠。將 ODex、MGel、4A-PEG-Acr 按照 20 wt %的濃度溶于 PBS，用磁力攪拌器將其充分混勻。將 I2959 按照 1%的濃度溶于 DMSO 中，震蕩混勻。將上述四種溶液同時灌注在直徑為 10 mm 的圓柱形模具中，在 37℃下反應 15 min，然后用 5 mWcm-2 的紫外光（365nm）照射 5 分鐘，遂成膠。IPN 水凝膠合成的步驟如圖 2-1 所示。

第三軍醫(yī)大學碩士學位論文充分吹打均勻，隨后將水凝膠-細胞懸液加入圓柱形模具（直徑=10 mm，，在37℃下反應15 min，然后用5 mWcm-2的紫外光（365nm）照射5分鐘了TE-NP。將TE-NP置于本課題組前期自主研發(fā)的 智能化反饋調(diào)控組織軸施加及培養(yǎng)系統(tǒng)‖（如圖2-2所示）中進行長期培養(yǎng)液循環(huán)灌流培養(yǎng)，，每天
【學位授予單位】：第三軍醫(yī)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R681.53

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本文編號：2554178