【摘要】：[目的]構(gòu)建恒河猴HLA-G過表達(dá)腺病毒載體并鑒定；培養(yǎng)篩選恒河猴未成熟樹突狀細(xì)胞(immature dendritic cell, imDC)后用重組腺病毒載體進(jìn)行轉(zhuǎn)染,western blot檢測HLA-G目的基因的表達(dá)情況。[方法](一)過表達(dá)腺病毒載體構(gòu)建：將目的載體和含有目的基因的質(zhì)粒進(jìn)行酶切,酶切產(chǎn)物電泳回收后進(jìn)行交換,其產(chǎn)物轉(zhuǎn)化細(xì)菌感受態(tài)細(xì)胞。對長出的克隆進(jìn)行菌落PCR鑒定,再對PCR鑒定陽性的克隆進(jìn)行測序和比對分析,比對結(jié)果正確的即為構(gòu)建成功的目的質(zhì)粒。(二)目的質(zhì)粒的表達(dá)檢測：用恒河猴HLA-G目的基因過表達(dá)真核質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞,western btot檢測目的質(zhì)粒的表達(dá)情況。(三)AdMax腺病毒包裝系統(tǒng)對恒河猴HLA-G過表達(dá)腺病毒載體進(jìn)行包裝、擴(kuò)增,Adeno-X純化試劑盒純化病毒,終點稀釋法檢測腺病毒滴度。(四)恒河猴樹突狀細(xì)胞的培養(yǎng)及腺病毒感染效率檢測。(五) Western blot檢測HLA-G在恒河猴未成熟樹突狀細(xì)胞中的表達(dá)。[結(jié)果]通過對長出的克隆進(jìn)行菌落PCR鑒定,陽性轉(zhuǎn)化子PCR產(chǎn)物大小為618bp,與理論值相符。對PCR鑒定陽性的克隆進(jìn)行測序和比對分析,并且比對結(jié)果正確,表明成功構(gòu)建了目的質(zhì)粒。目的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞,經(jīng)western blot檢測,可以觀察到18KD附近有特征條帶,其大小與目的基因融合蛋白相吻合。結(jié)果說明目的基因過表達(dá)OK。經(jīng)終點稀釋法測得腺病毒滴度為1×|011/ml。重組腺病毒感染恒河猴未成熟樹突狀細(xì)胞,western blot檢測見42KD處出現(xiàn)特異性條帶,與目的蛋白大小一致。[結(jié)論]通過HLA-G與腺病毒載體連接成功構(gòu)建恒河猴HLA-G腺病毒載體,后續(xù)用重組腺病毒載體感染未成熟樹突狀細(xì)胞,經(jīng)western blot檢測HLA-G可以在恒河猴imDC中穩(wěn)定的表達(dá)。[展望]通過重組腺病毒感染未成熟樹突狀細(xì)胞,希望獲得致耐受性樹突狀細(xì)胞,下一步將樹突狀細(xì)胞注射入受體門靜脈中研究恒河猴肝移植免疫耐受。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：昆明醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R617

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本文編號：2489741