【摘要】：研究背景：下腰痛是一個(gè)重要的公共衛(wèi)生問題,它是導(dǎo)致45歲以下人群勞動(dòng)能力受限的最主要原因。流行病學(xué)調(diào)查顯示,全世界約70%的成年人口在一生中至少經(jīng)歷過一次下腰痛。在美國(guó)下腰痛每年造成的經(jīng)濟(jì)損失約900億美元,中國(guó)衛(wèi)生統(tǒng)計(jì)年鑒顯示2008年我國(guó)下腰痛位于所有慢性病患病率的第六位,可見在我國(guó)下腰痛造成的社會(huì)生產(chǎn)力損失同樣十分巨大。雖然目前下腰痛的確切病因尚未完全闡明,但椎間盤退變無疑是一個(gè)重要的誘因。椎間盤內(nèi)的髓核細(xì)胞通過分泌細(xì)胞外基質(zhì)維持椎間盤功能,其數(shù)量減少和隨之帶來的細(xì)胞外基質(zhì)代謝失衡是椎間盤退變重要的病理生理變化。近年來,細(xì)胞移植治療椎間盤退變方興未艾,間充質(zhì)干細(xì)胞具有向髓核樣表型分化的能力,在椎間盤退變的生物學(xué)修復(fù)領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。然而,由于椎間盤為乏血供組織,其能量代謝主要依靠糖酵解,導(dǎo)致其內(nèi)部產(chǎn)生酸性、高滲、低氧和炎癥因子蓄積的惡劣微環(huán)境,在椎間盤退變過程中上述微環(huán)境進(jìn)一步惡化,使得間充質(zhì)干細(xì)胞的代謝活力和生物學(xué)修復(fù)能力受到損害,而上述微環(huán)境因素中又以酸性微環(huán)境對(duì)間充質(zhì)干細(xì)胞損害作用最為明顯。有研究表明,人類椎間盤內(nèi)的pH值隨椎間盤退變程度的加重而下降。人類脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞具有獲取方便、供體部位損傷小、來源豐富和增殖能力強(qiáng)等優(yōu)勢(shì),是一種理想的椎間盤組織工程種子細(xì)胞。人類脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞的供體年齡可能是細(xì)胞活力的一個(gè)重要影響因素,退變椎間盤不同程度的酸性微環(huán)境對(duì)人類脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞生物學(xué)活力的損害程度也很可能存在差異。然而,不同年齡來源的人類脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)退變椎間盤不同程度酸性微環(huán)境的耐受情況目前尚不清楚,闡明退變椎間盤不同程度酸性微環(huán)境對(duì)不同年齡組供體來源的人類脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞存活、增殖和細(xì)胞外基質(zhì)代謝等生物學(xué)行為的影響,將為椎間盤生物學(xué)修復(fù)研究的種子細(xì)胞選擇提供重要參考。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn),脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)退變椎間盤存在一定的修復(fù)作用,但僅僅通過細(xì)胞移植、生長(zhǎng)因子及抗炎藥物注射等手段很難確保脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞植入后在退變椎間盤惡劣的微環(huán)境中長(zhǎng)期保持生物學(xué)活力并發(fā)揮修復(fù)作用。近年來有學(xué)者在椎間盤內(nèi)發(fā)現(xiàn)了間充質(zhì)干細(xì)胞存在的證據(jù),進(jìn)一步的研究證實(shí)在人類退變髓核和終板中存在間充質(zhì)干細(xì)胞,在人類纖維環(huán)中存在具有多向分化潛能的祖細(xì)胞；同時(shí),動(dòng)物的體內(nèi)研究也證實(shí)髓核中存在間充質(zhì)干細(xì)胞,并且發(fā)現(xiàn)這些內(nèi)源性間充質(zhì)干細(xì)胞在椎間盤內(nèi)存在一定的遷移和修復(fù)行為,提示這種新型組織特異性間充質(zhì)干細(xì)胞具有潛在的研究和應(yīng)用價(jià)值。目前,髓核間充質(zhì)干細(xì)胞的存在已經(jīng)被多項(xiàng)研究所證實(shí)。本課題組在前期工作中成功分離培養(yǎng)出大鼠髓核間充質(zhì)干細(xì)胞,它具有間充質(zhì)干細(xì)胞的一般特性,能夠?qū)崿F(xiàn)成軟骨、成脂和成骨分化,完全符合國(guó)際細(xì)胞治療協(xié)會(huì)關(guān)于間充質(zhì)干細(xì)胞的認(rèn)定標(biāo)準(zhǔn)。然而,作為一種新型組織特異性間充質(zhì)干細(xì)胞,髓核間充質(zhì)干細(xì)胞是否能夠成為一種更加合適的椎間盤組織工程種子細(xì)胞這個(gè)問題尚不得而知。比較退變椎間盤酸性微環(huán)境對(duì)髓核間充質(zhì)干細(xì)胞和脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞的存活、增殖和細(xì)胞外基質(zhì)代謝等重要生物學(xué)行為的影響,將有助于我們更好的理解這兩種間充質(zhì)干細(xì)胞的生物學(xué)特性,并對(duì)其在椎間盤生物學(xué)修復(fù)領(lǐng)域的應(yīng)用前景做出正確的評(píng)價(jià),從而為下一步開發(fā)具有潛在應(yīng)用價(jià)值的椎間盤干細(xì)胞修復(fù)技術(shù)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)�；谏鲜鲅芯窟M(jìn)展與前期工作,本課題主要從以下兩方面開展研究：(1)退變椎間盤酸性微環(huán)境對(duì)不同年齡組供體來源的人類脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞的活力、增殖以及細(xì)胞外基質(zhì)代謝等生物學(xué)行為的影響；(2)退變椎間盤酸性微環(huán)境對(duì)大鼠髓核間充質(zhì)干細(xì)胞和脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞的活力、增殖以及細(xì)胞外基質(zhì)代謝等生物學(xué)行為的影響。 第一部分：退變椎間盤酸性微環(huán)境對(duì)人類脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞生物學(xué)行為的影響 目的：研究退變椎間盤酸性微環(huán)境對(duì)不同年齡組供體來源的人類脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞的存活、增殖以及細(xì)胞外基質(zhì)代謝等生物學(xué)行為的影響,探索適合進(jìn)行脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞移植干預(yù)的椎間盤微環(huán)境pH閩值,明確供體年齡對(duì)人類脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞酸性微環(huán)境適應(yīng)能力的影響。 方法：人類脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞根據(jù)供體來源分為未成年組(8-12歲,n=6)和成年組(33-42歲,n=6)。設(shè)立pH值7.4的培養(yǎng)條件作為標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)條件,使用pH值為7.1,6.8和6.5的培養(yǎng)條件分別模擬正常椎間盤、輕度退變椎間盤和嚴(yán)重退變椎間盤的酸性微環(huán)境特征。采用異硫氰酸熒光素橋連膜聯(lián)蛋白-V/碘化丙啶染色(Fluorescein isothiocyanate-Annexin-V/propidium iodide staining, FITC-AV/PI)測(cè)定細(xì)胞存活。采用MTT (3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyl tetrazolium bromide,3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴鹽)法測(cè)定細(xì)胞增殖。使用實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)(Real-Time PCR)檢測(cè)聚集蛋白聚糖(Aggrecan)、 I型膠原(Collagen-I)、 II型膠原(Collagen-II)、基質(zhì)金屬蛋白酶2(Matrix metalloproteinase-2, MMP-2)、金屬蛋白酶組織抑制3(Tissue inhibitor of metalloproteinase-3, TIMP-3), p53和細(xì)胞凋亡蛋白酶3(Caspase-3)的mRNA表達(dá)水平,使用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法(Enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)測(cè)定聚集蛋白聚糖、Ⅰ型膠原、Ⅱ型膠原、MMP-2和TIMP-3的蛋白表達(dá)水平。 結(jié)果：退變椎間盤酸性微環(huán)境能夠降低未成年組和成年組供體來源的人類脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞的存活和增殖能力,并且抑制它們的聚集蛋白聚糖、Ⅰ型膠原和Ⅱ型膠原的基因和蛋白表達(dá)水平。未成年組和成年組供體來源的人類脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)退變椎間盤酸性微環(huán)境的應(yīng)答模式相似,但是未成年組供體來源的人類脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)退變椎間盤酸性微環(huán)境的耐受能力強(qiáng)于成年組供體來源的人類脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞。 結(jié)論：本研究顯示退變椎間盤酸性微環(huán)境是人類脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞用于椎間盤生物學(xué)修復(fù)的重要有害因素,來源于未成年組供體的人類脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞可能更加適合用于椎間盤生物學(xué)修復(fù),人類脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞用于椎間盤生物學(xué)修復(fù)可能在退變?cè)缙?當(dāng)退變椎間盤病理組織微環(huán)境pH值大于6.8時(shí))更加有效。 第二部分：退變椎間盤酸性微環(huán)境對(duì)大鼠髓核間充質(zhì)干細(xì)胞和脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞生物學(xué)行為的影響 目的：研究退變椎間盤酸性微環(huán)境對(duì)大鼠髓核間充質(zhì)干細(xì)胞和脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞的存活、增殖以及細(xì)胞外基質(zhì)代謝等生物學(xué)行為的影響。 方法：我們將從健康雄性大鼠身上提取的髓核間充質(zhì)干細(xì)胞和脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞分別在四種不同的pH條件下進(jìn)行培養(yǎng),分別是標(biāo)準(zhǔn)條件(pH7.4)和模擬正常、輕度退變和重度退變的椎間盤微環(huán)境(pH值分別為7.1,6.8和6.5)；采用異硫氰酸熒光素橋連膜聯(lián)蛋白-V/碘化丙啶染色(Fluorescein isothiocyanate-Annexin-V/propidium iodide staining, FITC-AV/PI)評(píng)價(jià)細(xì)胞存活,CCK-8(Cell counting kit-8)測(cè)定細(xì)胞增殖,實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)(Real-Time PCR)和蛋白印跡法(Western blot)檢測(cè)聚集蛋白聚糖(Aggrecan)、I型膠原(Collagen-I)、 II型膠原(Collagen-II)、基質(zhì)金屬蛋白酶2(Matrix metalloproteinase-2, MMP-2). IV型血小板結(jié)合蛋白基序的解聚蛋白樣金屬蛋白酶(A disintegrin and metalloproteinase with thrombospondin motifs4, ADAMTS4)和金屬蛋白酶組織抑制劑3(Tissue inhibitor of metalloproteinase-3, TIMP-3)的基因和蛋白表達(dá)水平。 結(jié)果：退變椎間盤酸性微環(huán)境能夠顯著抑制大鼠髓核間充質(zhì)干細(xì)胞和脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞的存活與增殖；同時(shí),該酸性微環(huán)境能夠抑制上述兩種間充質(zhì)干細(xì)胞中聚集蛋白聚糖、Ⅰ型膠原、Ⅱ型膠原以及TIMP-3的基因和蛋白表達(dá)水平,并且提高M(jìn)MP-2和ADAMTS4的基因和蛋白表達(dá)水平。但是,與脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞相比,該酸性微環(huán)境對(duì)髓核間充質(zhì)干細(xì)胞的存活與增殖能力的抑制作用明顯較弱,同時(shí)髓核間充質(zhì)干細(xì)胞具有更高的聚集蛋白聚糖、Ⅱ型膠原和TIMP-3表達(dá)水平,以及更低的MMP-2和ADAMTS4表達(dá)水平。 結(jié)論：退變椎間盤的酸性微環(huán)境是髓核間充質(zhì)干細(xì)胞和脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞修復(fù)椎間盤的主要障礙之一；髓核間充質(zhì)干細(xì)胞較脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞更能耐受該酸性微環(huán)境,因而可能成為一種新型種子細(xì)胞用于椎間盤生物學(xué)修復(fù)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R681.53

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8 唐秋靈;人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞向男性生殖細(xì)胞分化的研究[D];汕頭大學(xué);2008年

9 徐小霞;人胎盤絨毛層間充質(zhì)干細(xì)胞體外培養(yǎng)的優(yōu)化及生物學(xué)特性的初步分析[D];蘇州大學(xué);2009年

10 王建軍;成人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞體外長(zhǎng)期培養(yǎng)及成骨潛能的實(shí)驗(yàn)研究[D];蘭州大學(xué);2009年

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本文編號(hào)：2446729