【摘要】：研究背景和目的應(yīng)用自體脂肪移植已有上百年的歷史,最初為塊狀或帶蒂移植,用于全身各個部位軟組織凹陷與缺損的填充。隨著脂肪抽吸技術(shù)的問世,使得顆粒脂肪注射移植技術(shù)成為可能,由于其來源豐富、取材容易、操作簡單、安全無排異反應(yīng)、外形自然、手感柔軟等優(yōu)點,近年來廣泛應(yīng)用于整形美容外科領(lǐng)域,如面部畸形、凹陷性瘢痕、皺紋、外傷后缺損、聲帶麻痹等,其中具有代表性的是隆乳和面部年輕化的軟組織填充。然而,顆粒脂肪移植后的高吸收活率和各種并發(fā)癥如鈣化、壞死、硬化結(jié)節(jié)和液化囊腫等限制了該顆粒脂肪注射移植技術(shù)在臨床的廣泛開展。因此,如何提高顆粒脂肪移植術(shù)后成活率,從而控制遠(yuǎn)期填充效果,成為整形外科臨床應(yīng)用及基礎(chǔ)理論研究中的重大難題之一。近十余年來眾多學(xué)者針對脂肪供區(qū)選擇、脂肪獲取方法、脂肪純化方式、脂肪注射方式等方面,從細(xì)胞因子治療、基因治療及細(xì)胞治療等多角度進(jìn)行了大量研究,以提高移植脂肪的成活,盡管上述種種方法在促進(jìn)移植物血管新生、預(yù)防或減輕纖維化、提高成活率方面取得了一定的效果。以往研究顯示,脂肪組織有著相當(dāng)豐富的血液供應(yīng),每個脂肪細(xì)胞都有單獨的血管供應(yīng)系統(tǒng)與主干相連以保證每個脂肪細(xì)胞的營養(yǎng)供應(yīng),形成類似葡萄串樣的結(jié)構(gòu)。在顆粒脂肪注射移植過程中脂肪的獲取、收集以及注射等對脂肪細(xì)胞以及供應(yīng)血管構(gòu)成損傷,僅殘留少部分的血管片段,嚴(yán)重影響到移植物的血液供應(yīng)。此外成熟的脂肪細(xì)胞內(nèi)含有一大脂肪滴,少量細(xì)胞器被擠向邊緣,特殊的細(xì)胞結(jié)構(gòu)決定了脂肪細(xì)胞的高耗能性,成熟的脂肪細(xì)胞很容易因缺血缺氧而發(fā)生壞死,從而影響移植脂肪的成活。顆粒脂肪移植早期移植物尚未與受區(qū)建立良好的血液供應(yīng)時,缺乏有效的血液供應(yīng)而處于缺血缺氧狀態(tài),脂肪移植物僅通過周圍組織的血漿灌注獲取氧及營養(yǎng),直至內(nèi)部血管化的形成及與毛細(xì)血管的連接建立。然而組織間液的滲透能力只有約150-200微米,在此滲透范圍以外的脂肪細(xì)胞應(yīng)該大部分發(fā)生壞死,但是對脂肪移植的長期標(biāo)本觀察發(fā)現(xiàn),脂肪移植物最終存活下來的區(qū)域并不僅限于由外周往內(nèi)部的150-200微米內(nèi)。這一結(jié)果提示在脂肪移植的后期過程中,存在著脂肪組織的新生與血運的重建。我們課題組前期實驗發(fā)現(xiàn),顆粒脂肪移植后血運重建主要是由宿主來源的新生血管長入而成,移植物絕大部分區(qū)域的細(xì)胞為宿主來源,因此宿主也就是受區(qū)的血管化條件、細(xì)胞再生條件在移植物成活過程中發(fā)揮著重要作用。目前對不同受區(qū)脂肪移植成活率的研究尚存有爭議,1996年Guerrerosantos首先在大鼠肌肉內(nèi)進(jìn)行脂肪移植獲得成功。Karacaoglu進(jìn)行了兔皮下、肌肉上、肌肉下脂肪移植的比較,發(fā)現(xiàn)6個月后咬肌上保存率約82%,其認(rèn)為可以通過選擇受區(qū)來提高脂肪移植的存活。但Rieck則發(fā)現(xiàn)移植脂肪的成活率為皮下30%,肌肉內(nèi)6%,肌肉內(nèi)注射并不增加成活,原因可能是肌肉間空隙小、張力大,雖然肌肉中血供豐富,但活動時肌肉收縮擠壓移植脂肪,反而影響血供。臨床方面,Yoshimura等認(rèn)為,胸大肌前后間隙血管豐富且利于乳房塑形,故此兩層次均適合注射脂肪,面部脂肪移植最佳的注射層次可能包括皮下脂肪和肌肉層。Coleman等認(rèn)為,不僅在胸大肌前后間隙,在胸大肌內(nèi)亦適合注射脂肪。李青峰認(rèn)為脂肪組織間的脂肪顆粒移植較其他部位有更高的存活率,受區(qū)組織生理同源性環(huán)境有利于移植脂肪的成活。究竟皮下、脂肪內(nèi)和肌肉內(nèi)何為顆粒脂肪移植的最佳受區(qū),目前尚無定量的實驗證實；對于不同移植部位所導(dǎo)致的成活率差異仍缺乏進(jìn)一步的研究�；谝陨峡茖W(xué)問題,本實驗將帶有綠色熒光小鼠的顆粒脂肪分別注射移植到普通C57小鼠的背部皮下、股二頭肌肌肉內(nèi)及腹股溝脂肪墊內(nèi),觀察不同組織層次移植脂肪的生存狀況,從而選擇最佳的脂肪移植受區(qū)。明確這個問題對提高脂肪移植成活率有著重要的意義。方法采用兩種近交系小鼠,將由GFP小鼠獲取的雙側(cè)腹股溝脂肪剪碎,通過16-gauge針頭將其分別注射移植到C57小鼠的雙側(cè)背部皮下、股二頭肌肌肉內(nèi)及腹股溝脂肪墊內(nèi),每個注射點注射量為0.1ml。實驗分為三組(每組35只)：皮下組(subcutaneous);肌肉內(nèi)組(intramusculary);脂肪內(nèi)組(fat pad)。1、濕重測量取0.1ml GFP鼠腹股溝粉碎脂肪稱重,做為之后脂肪移植物濕重基線,注射后每組分別于1、4、8、12、16周(W)處死小鼠各7只取材,并再測濕重(n=7)。得出移植物的濕重保存率。2、組織學(xué)觀察,毛細(xì)血管密度測量和結(jié)締組織定量將三組獲取的脂肪組織HE染色,切片顯微鏡觀察、數(shù)碼相機(jī)拍照。40倍鏡下觀察每個HE切片20個視野中毛細(xì)血管數(shù),評估新生血管形成。3、GFP表達(dá)和CD34、Ki67免疫組化染色熒光顯微鏡觀察冰凍切片綠色熒光表達(dá)。每個移植物100倍鏡下合成完整圖像,使用ImageJ軟件測定GFP陽性所占總面積的百分比,了解移植物中移植物來源組織所占比例。選取顆粒脂肪移植后4W的組織,進(jìn)行CD34、Ki67免疫組化染色以比較組織內(nèi)CD34陽性前體細(xì)胞數(shù)量,從而探討組織再生能力。4、統(tǒng)計學(xué)處理數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤(x±SEM)表示,使用統(tǒng)計軟件SPSS 13.0進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。所有數(shù)據(jù)采用重復(fù)測量方差分析,如果差異顯著同一個時間點三組之間采用獨立t檢驗；每組不同時間點的差異采用單向方差分析(ANOVA),P值0.05有統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)果1、大體觀察：1W時3組移植物表面均可見包膜形成,大體觀察無明顯差異。8W時脂肪內(nèi)組體積稍大于其他兩組,16W時脂肪內(nèi)組移植物體積明顯大于其他兩組移植物,且外觀上更接近正常脂肪。移植物的濕重保存率：三組移植物保存率均在移植后出現(xiàn)了明顯的下降,1-8W下降最為明顯,8-16W保存率趨于平穩(wěn)。脂肪內(nèi)組保存率第8周起即明顯高于皮下組及肌肉內(nèi)組(P0.05),16W皮下組保存率明顯高于肌肉內(nèi)組(P0.05)。2、組織學(xué)觀察：皮下組內(nèi)脂肪壞死區(qū)域較多,肌肉內(nèi)組最小。4W脂肪內(nèi)組及肌肉內(nèi)組移植物表現(xiàn)出更好的血管化和小體積脂肪細(xì)胞,至16W脂肪內(nèi)組及肌肉內(nèi)組移植物組織結(jié)構(gòu)十分接近正常脂肪組織,但肌肉內(nèi)組中成熟脂肪細(xì)胞的直徑明顯小于其他兩組。半定量測量：三組移植物的血管密度及血管化結(jié)締組織面積變化類似,移植后4周達(dá)到高峰,4W后較為緩和下降。肌肉內(nèi)組中的血管密度在移植后4周起即明顯高于其他兩組。結(jié)果提示肌肉內(nèi)移植物血管化最好,而長期觀察脂肪墊內(nèi)移植物成脂效果最好。3、三組移植物GFP陽性的區(qū)域隨時間逐漸減少,且集中于移植物外圍,半定量熒光面積在移植后1-8W下降明顯,8-16W緩和下降。肌肉內(nèi)組中的熒光面積比率從第4周開始即一直高于其余兩組(P0.05)。皮下組及脂肪內(nèi)組在各個時間點均無統(tǒng)計學(xué)差異。結(jié)果提示三組移植物外圍均可見來源于移植物的脂肪細(xì)胞存活,肌肉內(nèi)移植物來源脂肪細(xì)胞存活率最高。4WCD34、Ki67免疫組化染色,脂肪墊移植物內(nèi)有增殖活性的(Ki67表達(dá)陽性)CD34陽性細(xì)胞數(shù)量較多。討論Yoshimura等近期的研究指出,脂肪移植后的保存并非簡單的存活或替代,而是一種混合的保存方式：存活區(qū)(最外層)、壞死區(qū)(中央層)、再生區(qū)(外層和中央層之間),即移植物外層存活,內(nèi)層被ASCs參與的組織再生所取代,中央壞死區(qū)域被吸收或形成油囊,油囊的存在一定時間內(nèi)起到支架作用,使移植物保留一定的體積。因此,影響移植物遠(yuǎn)期保存的兩個根本因素為源自移植物組織的存活以及組織再生狀況。我們的實驗結(jié)果顯示肌肉內(nèi)移植的脂肪有著更好的血管再生和血管化纖維結(jié)締組織含量,在脂肪移植早期移植物依靠周圍組織的血漿灌注和營養(yǎng)供應(yīng)來保證存活,肌肉內(nèi)豐富的血供特性增加了移植物的營養(yǎng)供應(yīng),從而肌肉內(nèi)脂肪移植有更多移植物組織存活。我們進(jìn)一步的實驗結(jié)果顯示肌肉內(nèi)有更大的GPF陽性移植物來源的生存區(qū)域,證明了以上分析。然而有趣的是,濕重測量顯示脂肪墊內(nèi)最終成活率最高,而在血管環(huán)境最好的肌肉內(nèi)最終成活率最低。其原因何在?我們認(rèn)為可能有兩個原因,第一,Yoshimura等研究提示正常脂肪細(xì)胞耐受缺血缺氧能力很差,僅有移植物外圍小于300μm的范圍內(nèi)的脂肪細(xì)胞通過吸收滲透組織液的營養(yǎng)來度過缺血缺氧期,超過此有效距離的脂肪細(xì)胞大都壞死,接著在耐受缺血缺氧能力強(qiáng)的脂肪干細(xì)胞/間質(zhì)細(xì)胞/祖細(xì)胞啟動下新生的脂肪細(xì)胞替換死亡的脂肪細(xì)胞,脂肪移植后期成熟的脂肪細(xì)胞主要來源于干細(xì)胞啟動的再生。遠(yuǎn)期脂肪移植成活率是由之后的脂肪再生決定的,肌肉內(nèi)脂肪移植物中雖然有一定的移植物來源組織存活,但在移植物長期體積保存中所占比例較少,對遠(yuǎn)期體積保存的最終結(jié)果影響較少。第二,組織來源或宿主來源干細(xì)胞/祖細(xì)胞(如ASCs)在脂肪移植后脂肪再生中發(fā)揮著重要作用。有研究表明微環(huán)境決定了ASCs的命運和活性,脂肪墊內(nèi)含有大量ASCs以及各種細(xì)胞所分泌的了促進(jìn)成脂的因子,能為移植物提供一個適當(dāng)?shù)某芍h(huán)境,這是脂肪移植后脂肪再生的關(guān)鍵。ASCs的分化依賴于微環(huán)境,通過適當(dāng)?shù)乜刂苹瘜W(xué)和力學(xué)環(huán)境ASCs可以成為特異表達(dá)和優(yōu)先發(fā)展趨勢的脂肪細(xì)胞系。肌肉內(nèi)注射為脂肪移植提供足夠的血液供應(yīng),但并不能提供一個適當(dāng)?shù)闹拘纬傻奈h(huán)境。這可在一定程度上解釋了為什么即使有良好的血液供應(yīng),肌肉內(nèi)注射仍表現(xiàn)為較差的移植成活率。機(jī)械力引起的肌肉運動有可能抑制ASCs的成脂分化。有研究指出,游離脂肪加上肉毒素A聯(lián)合注射,可以顯著降低脂肪移植重吸收水平。脂肪組織的各種細(xì)胞,特別是ASCs,是有力學(xué)敏感性的。有研究發(fā)現(xiàn)靜態(tài)拉伸或低應(yīng)力可以促進(jìn)脂肪生成。然而動態(tài)機(jī)械力例如：循環(huán)拉伸或振動和靜態(tài)壓縮抑制脂肪生成。不僅機(jī)械力可以影響分化,而且基質(zhì)硬度直接針對性影響間充質(zhì)干細(xì)胞的分化。這或許可以解釋16W時為什么肌肉內(nèi)脂肪移植成熟脂肪細(xì)胞直徑與其它兩組相比顯著偏小,肌肉內(nèi)脂肪移植成活率低可能部分與肌肉運動有關(guān)。同樣的我們發(fā)現(xiàn)脂肪墊內(nèi)與皮下層脂肪移植后移植物毛細(xì)血管密度沒有明顯差異,但脂肪墊內(nèi)脂肪移植物比皮下層有更好的成活率。不同受區(qū)脂肪移植成活率的差異有可能是不同的生物、化學(xué)和物理微環(huán)境所導(dǎo)致,微環(huán)境可能在脂肪再生中發(fā)揮著關(guān)鍵性的作用。結(jié)論1、脂肪內(nèi)顆粒脂肪移植有較好的血管新生,能有效誘導(dǎo)脂肪再生,因此有最好的長期濕重保存率,脂肪內(nèi)是最佳的脂肪移植受區(qū)選擇。2、肌肉內(nèi)血供豐富,有利于移植脂肪的存活,但肌肉持續(xù)性運動可以抑制脂肪細(xì)胞的成脂分化,導(dǎo)致長期保存不佳。3、受區(qū)的微環(huán)境可能是影響脂肪移植成活的重要因素。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R622.9
【共引文獻(xiàn)】
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本文編號：
2443289
