【摘要】：研究背景血管化異體復(fù)合組織移植(Vascularized Composite Allotransplantation,VCA)是目前修復(fù)嚴(yán)重創(chuàng)傷、腫瘤切除、先天畸形等造成大面積組織缺損的有效手段之一,但術(shù)后通常需要終身服用免疫抑制劑,且急性排斥反應(yīng)發(fā)生率高,需要大劑量激素和免疫抑制劑沖擊治療,所帶來(lái)的嚴(yán)重藥物毒副作用限制了其臨床應(yīng)用。因此,如何誘導(dǎo)免疫耐受,從而減少或停用免疫抑制劑,成為VCA在臨床推廣應(yīng)用的突破口。胸腺作為機(jī)體重要的中樞免疫器官,對(duì)于自身免疫耐受和移植免疫耐受的誘導(dǎo)和維持具有重要作用,是移植免疫研究干預(yù)的主要靶點(diǎn)之一。已有大量研究發(fā)現(xiàn)胸腺內(nèi)注射供體抗原成分或抗原提呈細(xì)胞能有效誘導(dǎo)受體對(duì)異體移植物免疫耐受。有研究發(fā)現(xiàn),異體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(Bone Marrow-derived Mesenchymal stem cells,BMSCs)在受體胸腺微環(huán)境中能夠部位特異性分化為胸腺基質(zhì)細(xì)胞,而此類細(xì)胞在機(jī)體胸腺內(nèi)陽(yáng)性選擇和陰性選擇過(guò)程中起著關(guān)鍵作用,參與機(jī)體自身免疫耐受的誘導(dǎo)和維持。因此,將供體BMSCs胸腺內(nèi)注射至受體胸腺,也許能夠使其在受體胸腺微環(huán)境中部位特異性分化為胸腺基質(zhì)細(xì)胞,從而馴化受體T細(xì)胞,有可能誘導(dǎo)移植免疫耐受。目的體外分離培養(yǎng)、擴(kuò)增供體BN大鼠BMSCs,并將其胸腺內(nèi)注射至受體Lewis大鼠胸腺,聯(lián)合60Coγ射線4Gy全身照射,觀察其對(duì)同種異體腹部皮瓣移植物存活時(shí)間的影響。并對(duì)移植皮瓣進(jìn)行病理學(xué)檢查,比較各組移植皮瓣排斥反應(yīng)發(fā)生情況。通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組受體調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Regulatory T Cell,Treg)比例變化,并取受體脾臟淋巴細(xì)胞進(jìn)行單向混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)(Mixed Lymphocyte Reaction,MLR),比較各組受體淋巴細(xì)胞對(duì)供體抗原的反應(yīng)性,以初步探討其對(duì)移植排斥反應(yīng)影響的機(jī)制。方法全骨髓貼壁培養(yǎng)法分離BN大鼠BMSCs并嚴(yán)格控制換液和消化時(shí)間以對(duì)其進(jìn)行純化、擴(kuò)增。取所培養(yǎng)的P3代細(xì)胞,通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)對(duì)其表型進(jìn)行鑒定及誘導(dǎo)成脂、成骨能力鑒定。受體Lewis大鼠隨機(jī)分為A組(空白對(duì)照組)、B組(BMSCs組)、C組(60Coγ射線4Gy全身照射組)、D組(4Gy全身照射+BMSCs組)。各組大鼠第0天進(jìn)行同種異體腹部皮瓣移植,A組移植前14天胸腺內(nèi)注射磷酸鹽緩沖液(Phosphate Buffered Saline,PBS),B組移植前14天胸腺內(nèi)注射供體BMSCs,C組移植前15天給予60Coγ射線4Gy全身照射,移植前14天胸腺內(nèi)注射PBS,D組除移植前15天4Gy全身照射外,移植前14天胸腺內(nèi)注射供體BMSCs。移植后大體觀察比較移植皮瓣存活情況并繪制生存曲線;移植后第7天取移植皮瓣進(jìn)行病理學(xué)檢查;排斥終點(diǎn)流式檢測(cè)脾臟Treg比例變化,并采用體外單向MLR檢測(cè)受體脾淋巴細(xì)胞對(duì)供體抗原反應(yīng)性變化。結(jié)果全骨髓貼壁培養(yǎng)法能夠成功分離培養(yǎng)和擴(kuò)增出大量BMSCs,其P3代流式細(xì)胞術(shù)表型鑒定結(jié)果為CD29、CD44、CD90陽(yáng)性,而CD11b/c、CD34、CD45陰性,經(jīng)成脂、成骨誘導(dǎo)后可分化為脂肪細(xì)胞、骨細(xì)胞。B組的移植皮瓣存活時(shí)間與A組相比無(wú)明顯差異(P0.05),而D組的移植皮瓣平均存活時(shí)間較C組平均延長(zhǎng)3.4天,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01),脾細(xì)胞Treg比例顯著增高(P0.01),脾淋巴細(xì)胞對(duì)供體抗原反應(yīng)性顯著降低(P0.05)。且移植皮瓣病理學(xué)檢查表明D組與其他三組相比,其皮瓣內(nèi)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)較少,皮膚結(jié)構(gòu)較完整,排斥反應(yīng)較輕。結(jié)論全骨髓貼壁培養(yǎng)法是一種簡(jiǎn)便易行的分離培養(yǎng)BMSCs的方法,能夠擴(kuò)增出大量純度較高的BMSCs;胸腺內(nèi)注射供體BMSCs聯(lián)合60Coγ射線4Gy全身照射能夠顯著上調(diào)受體脾細(xì)胞Treg比例、降低受體淋巴細(xì)胞對(duì)供體抗原的反應(yīng)性,從而抑制受體對(duì)同種異體移植物的排斥反應(yīng),顯著延長(zhǎng)同種異體腹部皮瓣移植物存活時(shí)間。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R622

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本文編號(hào)：2418047