【摘要】：研究背景血管化異體復(fù)合組織移植(Vascularized Composite Allotransplantation,VCA)是目前修復(fù)嚴重創(chuàng)傷、腫瘤切除、先天畸形等造成大面積組織缺損的有效手段之一,但術(shù)后通常需要終身服用免疫抑制劑,且急性排斥反應(yīng)發(fā)生率高,需要大劑量激素和免疫抑制劑沖擊治療,所帶來的嚴重藥物毒副作用限制了其臨床應(yīng)用。因此,如何誘導(dǎo)免疫耐受,從而減少或停用免疫抑制劑,成為VCA在臨床推廣應(yīng)用的突破口。胸腺作為機體重要的中樞免疫器官,對于自身免疫耐受和移植免疫耐受的誘導(dǎo)和維持具有重要作用,是移植免疫研究干預(yù)的主要靶點之一。已有大量研究發(fā)現(xiàn)胸腺內(nèi)注射供體抗原成分或抗原提呈細胞能有效誘導(dǎo)受體對異體移植物免疫耐受。有研究發(fā)現(xiàn),異體骨髓間充質(zhì)干細胞(Bone Marrow-derived Mesenchymal stem cells,BMSCs)在受體胸腺微環(huán)境中能夠部位特異性分化為胸腺基質(zhì)細胞,而此類細胞在機體胸腺內(nèi)陽性選擇和陰性選擇過程中起著關(guān)鍵作用,參與機體自身免疫耐受的誘導(dǎo)和維持。因此,將供體BMSCs胸腺內(nèi)注射至受體胸腺,也許能夠使其在受體胸腺微環(huán)境中部位特異性分化為胸腺基質(zhì)細胞,從而馴化受體T細胞,有可能誘導(dǎo)移植免疫耐受。目的體外分離培養(yǎng)、擴增供體BN大鼠BMSCs,并將其胸腺內(nèi)注射至受體Lewis大鼠胸腺,聯(lián)合60Coγ射線4Gy全身照射,觀察其對同種異體腹部皮瓣移植物存活時間的影響。并對移植皮瓣進行病理學檢查,比較各組移植皮瓣排斥反應(yīng)發(fā)生情況。通過流式細胞術(shù)檢測各組受體調(diào)節(jié)性T細胞(Regulatory T Cell,Treg)比例變化,并取受體脾臟淋巴細胞進行單向混合淋巴細胞反應(yīng)(Mixed Lymphocyte Reaction,MLR),比較各組受體淋巴細胞對供體抗原的反應(yīng)性,以初步探討其對移植排斥反應(yīng)影響的機制。方法全骨髓貼壁培養(yǎng)法分離BN大鼠BMSCs并嚴格控制換液和消化時間以對其進行純化、擴增。取所培養(yǎng)的P3代細胞,通過流式細胞術(shù)對其表型進行鑒定及誘導(dǎo)成脂、成骨能力鑒定。受體Lewis大鼠隨機分為A組(空白對照組)、B組(BMSCs組)、C組(60Coγ射線4Gy全身照射組)、D組(4Gy全身照射+BMSCs組)。各組大鼠第0天進行同種異體腹部皮瓣移植,A組移植前14天胸腺內(nèi)注射磷酸鹽緩沖液(Phosphate Buffered Saline,PBS),B組移植前14天胸腺內(nèi)注射供體BMSCs,C組移植前15天給予60Coγ射線4Gy全身照射,移植前14天胸腺內(nèi)注射PBS,D組除移植前15天4Gy全身照射外,移植前14天胸腺內(nèi)注射供體BMSCs。移植后大體觀察比較移植皮瓣存活情況并繪制生存曲線;移植后第7天取移植皮瓣進行病理學檢查;排斥終點流式檢測脾臟Treg比例變化,并采用體外單向MLR檢測受體脾淋巴細胞對供體抗原反應(yīng)性變化。結(jié)果全骨髓貼壁培養(yǎng)法能夠成功分離培養(yǎng)和擴增出大量BMSCs,其P3代流式細胞術(shù)表型鑒定結(jié)果為CD29、CD44、CD90陽性,而CD11b/c、CD34、CD45陰性,經(jīng)成脂、成骨誘導(dǎo)后可分化為脂肪細胞、骨細胞。B組的移植皮瓣存活時間與A組相比無明顯差異(P0.05),而D組的移植皮瓣平均存活時間較C組平均延長3.4天,差異具有統(tǒng)計學意義(P0.01),脾細胞Treg比例顯著增高(P0.01),脾淋巴細胞對供體抗原反應(yīng)性顯著降低(P0.05)。且移植皮瓣病理學檢查表明D組與其他三組相比,其皮瓣內(nèi)炎癥細胞浸潤較少,皮膚結(jié)構(gòu)較完整,排斥反應(yīng)較輕。結(jié)論全骨髓貼壁培養(yǎng)法是一種簡便易行的分離培養(yǎng)BMSCs的方法,能夠擴增出大量純度較高的BMSCs;胸腺內(nèi)注射供體BMSCs聯(lián)合60Coγ射線4Gy全身照射能夠顯著上調(diào)受體脾細胞Treg比例、降低受體淋巴細胞對供體抗原的反應(yīng)性,從而抑制受體對同種異體移植物的排斥反應(yīng),顯著延長同種異體腹部皮瓣移植物存活時間。
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【學位授予單位】：第四軍醫(yī)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R622

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本文編號：2418047