【摘要】：第一部分神經(jīng)病理性疼痛中脊髓小膠質(zhì)細(xì)胞極化狀態(tài)的變化情況及其對(duì)疼痛行為學(xué)的影響目的觀測(cè)神經(jīng)病理性疼痛大鼠脊髓小膠質(zhì)細(xì)胞極化狀態(tài)的變化情況及其對(duì)疼痛行為學(xué)影響(1)觀測(cè)SNL神經(jīng)損傷致神經(jīng)病理性疼痛大鼠的疼痛行為學(xué)及其脊髓小膠質(zhì)細(xì)胞的極化狀態(tài)變化情況;(2)觀測(cè)STZ致糖尿病性神經(jīng)痛大鼠的疼痛行為學(xué)及其脊髓小膠質(zhì)細(xì)胞的極化狀態(tài)變化情況;(3)離體實(shí)驗(yàn)中,觀測(cè)LPS、IL-4刺激誘導(dǎo)BV2小膠質(zhì)細(xì)胞極化狀態(tài)的變化情況;(4)離體實(shí)驗(yàn)中,觀測(cè)LPS、IL-4刺激誘導(dǎo)原代小膠質(zhì)細(xì)胞極化狀態(tài)的變化情況;(5)鞘內(nèi)注入經(jīng)LPS、IL-4孵育的原代小膠質(zhì)細(xì)胞,觀測(cè)大鼠疼痛行為學(xué)的變化。方法(1)觀測(cè)SNL神經(jīng)損傷致神經(jīng)病理性疼痛大鼠的疼痛行為學(xué)及其脊髓小膠質(zhì)細(xì)胞的極化狀態(tài)變化情況選取6只大鼠行SNL術(shù),術(shù)后用von Frey纖維絲以u(píng)p-down法推算大鼠的機(jī)械縮足痛閾值(PWT)兩周,觀測(cè)SNL神經(jīng)損傷致神經(jīng)病理性疼痛大鼠的行為學(xué);另取18只大鼠隨機(jī)分為3組(n=6):分別為對(duì)照組、假手術(shù)組和SNL組。在術(shù)后第7天,急性分離脊髓腰膨大處的小膠質(zhì)細(xì)胞,行流式細(xì)胞學(xué)檢測(cè),評(píng)估SNL大鼠脊髓小膠質(zhì)細(xì)胞極化平衡的變化情況。(2)觀測(cè)STZ致糖尿病性神經(jīng)痛大鼠的疼痛行為學(xué)及其脊髓小膠質(zhì)細(xì)胞的極化狀態(tài)變化情況選取6只大鼠腹腔注射STZ,術(shù)后定期測(cè)定大鼠血糖,并以von Frey纖維絲以u(píng)p-down法推算大鼠的機(jī)械縮足痛閾值(PWT),為期4周,并設(shè)置相應(yīng)對(duì)照組,觀測(cè)STZ致糖尿病性神經(jīng)痛大鼠的行為學(xué);另取12只大鼠隨機(jī)分為2組(n=6):分別為對(duì)照組、STZ組。在術(shù)后第14天,急性分離腰膨大處脊髓中的小膠質(zhì)細(xì)胞,行流式細(xì)胞學(xué)檢測(cè),評(píng)估STZ大鼠脊髓小膠質(zhì)細(xì)胞極化狀態(tài)的變化情況。(3)離體實(shí)驗(yàn)中,觀測(cè)LPS、IL-4刺激誘導(dǎo)BV2小膠質(zhì)細(xì)胞極化狀態(tài)變化情況分別用LPS(1mg/ml)、IL-4(20μg/ml)孵育BV2小膠質(zhì)細(xì)胞24小時(shí)。實(shí)驗(yàn)細(xì)胞分為對(duì)照組、LPS組和IL-4組。以Western Blot測(cè)定各組細(xì)胞中M1型小膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記蛋白i NOS和M2型小膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記蛋白Arg的蛋白表達(dá)情況;以流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定各組細(xì)胞中M1型小膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記蛋白CD86和M2型小膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記蛋白CD206的蛋白表達(dá)情況;以免疫熒光共聚焦測(cè)定各組細(xì)胞中M1型小膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記蛋白i NOS和M2型小膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記蛋白Arg的蛋白熒光強(qiáng)度。(4)離體實(shí)驗(yàn)中,觀測(cè)LPS、IL-4刺激誘導(dǎo)原代小膠質(zhì)細(xì)胞極化狀態(tài)變化情況分別用LPS(1mg/ml)、IL-4(20μg/ml)孵育BV2小膠質(zhì)細(xì)胞24小時(shí)。實(shí)驗(yàn)細(xì)胞分為對(duì)照組、LPS組和IL-4組。以Western Blot測(cè)定各組細(xì)胞中M1型小膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記蛋白i NOS和M2型小膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記蛋白CD206的蛋白表達(dá)情況以免疫熒光共聚焦測(cè)定各組細(xì)胞中M1型小膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記蛋白CD86和M2型小膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記蛋白Arg的蛋白熒光強(qiáng)度。(5)鞘內(nèi)注入經(jīng)LPS、IL-4孵育的原代小膠質(zhì)細(xì)胞,觀測(cè)大鼠疼痛行為學(xué)的變化將經(jīng)LPS誘導(dǎo)的以M1型為主的原代小膠質(zhì)細(xì)胞和經(jīng)IL-4誘導(dǎo)的以M2型為主的原代小膠質(zhì)細(xì)胞分別鞘內(nèi)注射入正常大鼠體內(nèi),用von Frey纖維絲以u(píng)p-down法推算大鼠的機(jī)械縮足痛閾值(PWT),觀測(cè)大鼠疼痛行為學(xué)的變化情況;將經(jīng)LPS誘導(dǎo)的以M1型為主的原代小膠質(zhì)細(xì)胞和經(jīng)IL-4誘導(dǎo)的以M2型為主的原代小膠質(zhì)細(xì)胞分別鞘內(nèi)注射入神經(jīng)病理性疼痛大鼠體內(nèi),用von Frey纖維絲以u(píng)p-down法推算大鼠的機(jī)械縮足痛閾值(PWT),觀測(cè)大鼠疼痛行為學(xué)的變化情況。結(jié)果(1)SNL組大鼠手術(shù)同側(cè)后肢50%PWT較基礎(chǔ)值進(jìn)行性下降,術(shù)后第一天即下降至基礎(chǔ)水平的43%,(p0.01),術(shù)后第3天達(dá)到低水平(18%,p0.01),以后在整個(gè)觀察期間均維持在該水平。而術(shù)后第7天,SNL組大鼠手術(shù)同側(cè)脊髓腰膨大處小膠質(zhì)細(xì)胞中M1型標(biāo)記蛋白CD86較假手術(shù)組、對(duì)照組明顯升高(p0.01)。(2)STZ組大鼠注藥后血糖進(jìn)行性升高,術(shù)后三天達(dá)到高值,且在整個(gè)觀察期間均維持在該高水平(p0.01)。同時(shí),STZ組大鼠體重較對(duì)照組增長(zhǎng)明顯緩慢(p0.01),后肢50%PWT較基礎(chǔ)值進(jìn)行性下降,術(shù)后一周即下降至基礎(chǔ)水平的51%(p0.01)以后在整個(gè)觀察其間均維持在該低水平。而術(shù)后第14天,STZ組大鼠脊髓腰膨大處小膠質(zhì)細(xì)胞中M1型標(biāo)記蛋白CD86較對(duì)照組明顯升高(p0.01)。(3)經(jīng)LPS、IL-4孵育BV2小膠質(zhì)細(xì)胞后,Western Blot示LPS組M1型標(biāo)記蛋白i NOS較其他兩組明顯升高(p0.01),IL-4組M2型標(biāo)記蛋白Arg較其余兩組明顯升高(p0.01);流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)示,LPS組M1型標(biāo)記蛋白CD86較其他兩組明顯升高,IL-4組M2型標(biāo)記蛋白CD206較其余兩組明顯升高(p0.01);免疫熒光共聚焦亦顯示LPS組M1型標(biāo)記蛋白i NOS熒光強(qiáng)度較其他兩組明顯升高,IL-4組M2型標(biāo)記蛋白Arg熒光強(qiáng)度較其余兩組明顯升高(p0.01)。(4)經(jīng)LPS、IL-4孵育原代小膠質(zhì)細(xì)胞后,Western Blot示LPS組M1型標(biāo)記蛋白i NOS較其他兩組明顯升高,IL-4組M2型標(biāo)記蛋白CD206較其余兩組明顯升高(p0.01);免疫熒光共聚焦亦顯示LPS組M1型標(biāo)記蛋白CD86較其他兩組明顯升高,IL-4組M2型標(biāo)記蛋白Arg較其余兩組明顯升高(p0.01)。(5)將經(jīng)LPS孵育的原代小膠質(zhì)細(xì)胞鞘內(nèi)注入正常大鼠體內(nèi),大鼠的機(jī)械痛閾較對(duì)照組明顯降低,提示M1型小膠質(zhì)細(xì)胞可以促進(jìn)疼痛行為學(xué)。(6)將經(jīng)IL-4孵育的原代小膠質(zhì)細(xì)胞鞘內(nèi)注入糖尿病性神經(jīng)痛和SNL神經(jīng)損傷致神經(jīng)病理性疼痛大鼠體內(nèi),疼痛大鼠的機(jī)械痛閾明顯升高,提示M2型小膠質(zhì)細(xì)胞可以緩解疼痛。結(jié)論脊髓小膠質(zhì)細(xì)胞極化狀態(tài)的改變參與了神經(jīng)病理性疼痛的調(diào)控,其間M1型可以促進(jìn)疼痛行為學(xué);相反的,M2型可以緩解疼痛行為學(xué)。第二部分ATP調(diào)控小膠質(zhì)細(xì)胞極化狀態(tài)進(jìn)而參與神經(jīng)病理性疼痛的機(jī)制研究目的探究ATP調(diào)控小膠質(zhì)細(xì)胞極化狀態(tài)進(jìn)而參與神經(jīng)病理性疼痛的機(jī)制(1)離體實(shí)驗(yàn)中,ATP對(duì)BV2小膠質(zhì)細(xì)胞極化狀態(tài)的影響;(2)鞘內(nèi)注入經(jīng)不同濃度ATP孵育的原代小膠質(zhì)細(xì)胞對(duì)大鼠疼痛行為學(xué)的影響。方法(1)離體實(shí)驗(yàn)中,ATP對(duì)BV2小膠質(zhì)細(xì)胞極化狀態(tài)的影響不同濃度ATP孵育BV2小膠質(zhì)細(xì)胞24小時(shí)后,分別以Western Blot、流式細(xì)胞術(shù)和免疫熒光共聚焦測(cè)定各組細(xì)胞中M1型和M2型小膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記蛋白的表達(dá)變化情況;以低濃度ATP(10μM)+LPS孵育BV2小膠質(zhì)細(xì)胞24小時(shí)后,分別以Western Blot、流式細(xì)胞術(shù)和免疫熒光共聚焦測(cè)定各組細(xì)胞中M1型和M2型小膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記蛋白的表達(dá)變化情況。(2)鞘內(nèi)注入經(jīng)不同濃度ATP孵育的原代小膠質(zhì)細(xì)胞對(duì)大鼠疼痛行為學(xué)的影響分別將經(jīng)低濃度ATP(10μM)、LPS、ATP(10μM)+LPS孵育的原代小膠質(zhì)細(xì)胞經(jīng)鞘內(nèi)注入正常大鼠體內(nèi),觀測(cè)大鼠疼痛行為學(xué)的變化;分別將經(jīng)高濃度ATP(1m M)、IL-4孵育的原代小膠質(zhì)細(xì)胞鞘內(nèi)注入神經(jīng)病理性疼痛大鼠體內(nèi),觀測(cè)大鼠疼痛行為學(xué)的變化。結(jié)果(1)經(jīng)不同濃度ATP孵育BV2小膠質(zhì)細(xì)胞24小時(shí)后,Western Blot示低濃度組中M1型標(biāo)記蛋白i NOS無(wú)明顯變化,而高濃度組i NOS表達(dá)下調(diào)(p0.01);流式細(xì)胞術(shù)示低濃度組M1型標(biāo)記蛋白CD86和M2型標(biāo)記蛋白CD206無(wú)明顯變化,而高濃度組CD86表達(dá)下調(diào),CD206表達(dá)增高(p0.01);免疫熒光共聚焦亦顯示低濃度組M1型標(biāo)記蛋白i NOS和M2型標(biāo)記蛋白Arg無(wú)明顯變化,僅在高濃度組i NOS表達(dá)減少,Arg表達(dá)上調(diào)(p0.01)。(2)以低濃度ATP(10μM)+LPS孵育BV2小膠質(zhì)細(xì)胞24小時(shí)后,Western Blot示ATP組M1型標(biāo)記蛋白i NOS表達(dá)較對(duì)照組無(wú)明顯差異,而ATP+LPS組較單純LPS組及對(duì)照組i NOS表達(dá)均明顯增高(p0.01);流式細(xì)胞術(shù)示ATP組M1型標(biāo)記蛋白CD86和M2型標(biāo)記蛋白CD206無(wú)明顯變化,而ATP+LPS組CD86表達(dá)上調(diào),CD206表達(dá)下降(p0.01);免疫熒光共聚焦亦顯示ATP組M1型標(biāo)記蛋白i NOS和M2型標(biāo)記蛋白Arg無(wú)明顯變化,僅在ATP+LPS組i NOS表達(dá)增高,Arg表達(dá)下降(p0.01)。(3)將經(jīng)低濃度ATP+LPS孵育的原代小膠質(zhì)細(xì)胞經(jīng)鞘內(nèi)注入正常大鼠體內(nèi),大鼠的機(jī)械痛閾明顯降低(p0.01),且持續(xù)時(shí)間較ATP組、LPS組明顯延長(zhǎng),提示低劑量ATP可以增強(qiáng)LPS誘導(dǎo)M1型小膠質(zhì)細(xì)胞的能力,進(jìn)而促進(jìn)疼痛的發(fā)生。(4)將經(jīng)高濃度ATP孵育的原代小膠質(zhì)細(xì)胞鞘內(nèi)注入神經(jīng)病理性疼痛大鼠體內(nèi),疼痛大鼠的機(jī)械痛閾明顯升高(p0.01),提示高濃度ATP可以誘導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞向M2型極化,進(jìn)而緩解疼痛行為學(xué)。結(jié)論ATP可以調(diào)控小膠質(zhì)細(xì)胞的極化狀態(tài)進(jìn)而參與神經(jīng)病理型疼痛的發(fā)生發(fā)展,低濃度ATP可以增強(qiáng)LPS誘導(dǎo)M1型小膠質(zhì)細(xì)胞的能力,促進(jìn)疼痛;而高濃度ATP可以直接誘導(dǎo)M2型小膠質(zhì)細(xì)胞,緩解疼痛行為學(xué)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：上海交通大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R614

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