【摘要】：【背景】肝臟移植是根治終末期肝病唯一有效手段,移植術(shù)后患者將面臨免疫排斥導(dǎo)致的移植物失功能和免疫抑制劑終生使用帶來高感染率、高腫瘤發(fā)生和復(fù)發(fā)率、高昂的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)等問題。如何減少和避免免疫抑制劑的應(yīng)用,是肝臟移植研究領(lǐng)域的重要方向[1]。免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞的細(xì)胞學(xué)治療使其成為可能[2]。而目前公認(rèn)的具有免疫調(diào)控能力的細(xì)胞為im DC和Treg。當(dāng)前認(rèn)為im DC和Treg在調(diào)控免疫中相互促進(jìn),協(xié)同作用。已知im DC促進(jìn)Treg分化并且擴(kuò)增Treg,而Treg能幫助im DC保持其未分化狀態(tài)。不過總體來說im DC處于中心地位[3]。但是其受限于保存時間短,體內(nèi)易被激活成熟,因而治療性研究受到限制�？上驳氖�,研究發(fā)現(xiàn)DC分泌的膜性微囊—Exosome,表面富含免疫相關(guān)分子,并內(nèi)含DC所提呈的外源性抗原,甚至具有一定量的遺傳物質(zhì),且性質(zhì)穩(wěn)定,低溫下可長久保存[4]。為解決上述DC治療性研究受限制及誘導(dǎo)耐受效果弱等問題,文獻(xiàn)報(bào)道和前期研究都利用了供體im DC來源的Exosome(im Dex)探究其保護(hù)移植物的作用。結(jié)果表明供體來源im Dex可一定程度上延長鼠類心臟和小腸移植物的存活時間,且該保護(hù)效果與體內(nèi)Treg比例有密切關(guān)系[5,6]。另外如需誘導(dǎo)出理想的耐受狀態(tài)還需聯(lián)合小劑量免疫抑制藥物才可行。我們猜想,與im DC相似,im Dex在體內(nèi)可能也是通過擴(kuò)增Treg數(shù)量和增強(qiáng)其功能來發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)�！灸康摹繛榱诉M(jìn)一步減少免疫抑制藥物的使用,并且驗(yàn)證我們的猜想。我們構(gòu)建了近交系大鼠原位肝臟移植模型,在體內(nèi)外試驗(yàn)中聯(lián)用供體來源im Dex和抗原特異性Treg,觀察二者聯(lián)用的免疫調(diào)節(jié)效果,探究im Dex與Treg之間的作用關(guān)系�！痉椒ā恳訠N/F344大鼠為供體,Lewis大鼠為受體,建立大鼠原位肝臟移植模型。利用超高速梯度離心法獲得供體im Dex。電子顯微鏡和流式細(xì)胞術(shù)對im Dex進(jìn)行形態(tài)學(xué)和分子表型鑒定。對移植受體行不同劑量im Dex處理,再進(jìn)行生存分析探究其對肝臟移植物的保護(hù)作用,并探索該作用與劑量之間的關(guān)系。利用兩步免疫磁珠分選技術(shù)分選受體脾臟來源CD4+CD25+T細(xì)胞,而后與供體抗原提呈細(xì)胞共培養(yǎng),獲得供體抗原預(yù)刺激的Treg。流式鑒定其功能分子的變化,體外實(shí)驗(yàn)鑒定其免疫抑制效果。不同來源和不同特異性的Treg用于移植受體,驗(yàn)證抗原特異性對于Treg在移植免疫中的重要性。進(jìn)一步體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中聯(lián)合im Dex和Treg,應(yīng)用生存分析,組織形態(tài)學(xué)和混合淋巴細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)觀察兩者聯(lián)用對移植物可能的保護(hù)作用和受體體內(nèi)免疫狀態(tài)的變化。體外實(shí)驗(yàn)探究im Dex對Treg的作用,體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中,用CFSE標(biāo)記Treg聯(lián)合im Dex輸注受體,觀察Treg的增殖與im Dex之間的關(guān)系,驗(yàn)證體外結(jié)論�！窘Y(jié)果】1)以超高速梯度離心法分離出較好保持了im DC表型的im Dex,其最佳作用劑量為20μg。2)具有供體抗原特異性Treg對移植物的保護(hù)作用顯著高于單純磁珠分選后的自然Treg(P0.05)。3)Im Dex和Treg兩者聯(lián)用組生存時間長于對照組(P0.01),聯(lián)用組受體移植物10th天和40th天免疫排斥反應(yīng)輕微,體內(nèi)T細(xì)胞增殖活性及其細(xì)胞因子分泌均減低,外源性輸注的Treg體內(nèi)出現(xiàn)顯著增殖,并且在受體移植物、脾臟、淋巴結(jié)中均有分布。4)進(jìn)一步體外實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)imDex可以擴(kuò)增Treg,5th天imDex高劑量組Treg增殖比例更高,但是7th后不同劑量im Dex處理Treg增殖效果相似,這提示im Dex的體內(nèi)應(yīng)用可能不需要過高劑量,這與前述的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果相符。5)對體內(nèi)Treg的檢測表明,im Dex聯(lián)合處理組Treg增殖顯著高于單純的外源性Treg處理組,驗(yàn)證了體外的實(shí)驗(yàn)結(jié)果�！窘Y(jié)論】供體來源im Dex可以保護(hù)大鼠移植肝臟,本研究的分離和凍存方法穩(wěn)定可靠。im Dex的應(yīng)用一定程度上解決了im DC體外難以長期保存的難題;我們發(fā)現(xiàn)聯(lián)合Treg細(xì)胞后可以實(shí)現(xiàn)穩(wěn)定的移植免疫耐受狀態(tài)。有望為臨床提供新的治療思路。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R657.3

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本文編號：2410649