【摘要】：研究背景難愈性創(chuàng)面常見于大面積燒傷、糖尿病足潰瘍、缺血性潰瘍、下肢靜脈曲張潰瘍、手術(shù)后感染、壓瘡等。由于患者營養(yǎng)狀況不良、細菌感染、難以控制的高血糖、創(chuàng)面局部血液循環(huán)障礙、全身或局部炎癥反應(yīng)重等多種因素,往往導(dǎo)致創(chuàng)面遷延不愈,嚴重影響患者的生活質(zhì)量和生命健康。創(chuàng)面愈合過程中參與組織修復(fù)的細胞發(fā)生大量凋亡,細胞功能損傷導(dǎo)致細胞因子分泌嚴重不足,細胞間交互協(xié)同活動紊亂,皮膚免疫微環(huán)境發(fā)生失衡,由此導(dǎo)致創(chuàng)面難以愈合。因此,深入研究創(chuàng)面修復(fù)過程中的細胞功能和細胞間相互作用及分子機制,對于研發(fā)對新的創(chuàng)面免疫治療方法非常重要。創(chuàng)面愈合的細胞生物學(xué)基礎(chǔ)依賴于表皮細胞快速增殖、遷移和分化,以及需多種多樣的細胞因子維持細胞存活和增殖,來促進創(chuàng)面快速修復(fù)。表皮細胞主要由90%的角質(zhì)細胞(keratinocytes,KCs)和少量在結(jié)構(gòu)上與其緊密相連的樹突狀表皮γδT細胞(dendritic epidermalγδT cells,DETCs)構(gòu)成。它們相互依存,共同調(diào)控正常的皮膚屏障功能,共同促進創(chuàng)傷的修復(fù)過程,維護皮膚表皮層免疫微環(huán)境的平衡和穩(wěn)定。雷帕霉素(rapamycin,雷帕霉素)最初被發(fā)現(xiàn)是一種來源于親水鏈霉素菌屬的抗真菌藥物,是一種特異性的哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)抑制劑。mTOR通路被認為可“管控一切細胞活動”,與細胞的生長、增殖、分化和新陳代謝密切相關(guān)。雷帕霉素因調(diào)控m TOR通路發(fā)揮其強大的免疫抑制功能,抗惡性腫瘤細胞增殖和抗腫瘤血管生成的功能,被廣泛用于預(yù)防器官移植后的急性免疫排斥反應(yīng)和部分惡性腫瘤的治療。近些年來雷帕霉素和mTOR通路對于創(chuàng)面愈合的影響也有所報道,但得到的結(jié)論并不一致。有研究報道雷帕霉素延遲創(chuàng)面愈合,而另有研究則認為雷帕霉素促進燒傷創(chuàng)面的早期愈合。本課題研究中,我們設(shè)定了不同劑量的雷帕霉素,研究其對表皮細胞數(shù)量及功能的影響,進一步觀察其對創(chuàng)面愈合的影響作用。通過檢測表皮細胞中角質(zhì)細胞分泌的IL-15和DETCs分泌的IGF-1的變化和相互關(guān)系,深入探索表皮中角質(zhì)細胞與DETCs交互協(xié)同的功能。通過體內(nèi)外的實驗研究我們發(fā)現(xiàn),雷帕霉素對表皮細胞的數(shù)量、功能的作用以及對創(chuàng)面的愈合的影響具有劑量依賴性及時間依賴性。小劑量的雷帕霉素通過調(diào)控Akt/m TORC2通路促進表皮細胞的功能和創(chuàng)面愈合的進程,而大劑量的雷帕霉素顯著抑制mTORC1通路,延長作用時間后亦可抑制表皮中的mTORC2通路,因此明顯延緩創(chuàng)面愈合過程。本研究為未來臨床創(chuàng)面及難愈性創(chuàng)面的免疫學(xué)治療提供了新的思路和新的機會。目的本研究探索雷帕霉素對表皮細胞和樹突狀表皮γδT細胞數(shù)量、功能的影響及其作用模式,以及由此對創(chuàng)面愈合產(chǎn)生的影響及其可能的機制。期望該研究能為未來臨床治療創(chuàng)面提供新的思路。方法1.不同劑量的雷帕霉素對表皮細胞生存的影響體外預(yù)實驗通過初步的細胞計數(shù)摸索出小劑量和大劑量雷帕霉素,CCK-8實驗觀察不同劑量雷帕霉素對表皮細胞數(shù)量的影響;2.不同劑量的雷帕霉素對DETCs數(shù)量的影響通過流式細胞技術(shù)檢測不同劑量雷帕霉素對表皮細胞中和創(chuàng)面愈合過程創(chuàng)周表皮中DETCs數(shù)量的影響;3.不同劑量的雷帕霉素對創(chuàng)面愈合的影響在體預(yù)實驗摸索出可影響創(chuàng)面愈合的小劑量和大劑量雷帕霉素。通過制作小鼠全層皮膚缺損的創(chuàng)面模型,繪制創(chuàng)面愈合曲線,HE染色測量新生上皮并計算,觀察不同劑量的雷帕霉素對創(chuàng)面愈合第0天到第7天的影響;4.不同劑量的雷帕霉素對IL-15和IGF-1表達的影響通過Real-time PCR、WB、細胞內(nèi)流式細胞技術(shù)及免疫組織化學(xué)法的方法檢測表皮細胞及創(chuàng)面愈合過程中創(chuàng)周表皮中IL-15和IGF-1的表達變化,進一步了解不同劑量雷帕霉素對表皮細胞免疫微環(huán)境的影響;5.不同劑量的雷帕霉素對m TORC1通路的影響通過WB方法檢測表皮細胞及創(chuàng)面愈合過程中m TORC1相關(guān)骨架蛋白Raptor,下游分子p70S6K和4E-BP1的表達變化,觀察不同劑量雷帕霉素在不同作用時間點對mTORC1信號通路的影響變化;6.不同劑量的雷帕霉素對m TORC2通路的影響通過WB方法檢測表皮細胞及創(chuàng)面愈合過程中m TORC2雷帕霉素不敏感伴隨復(fù)合物Rictor,SIN1及下游分子Akt的表達變化,觀察不同劑量雷帕霉素在不同作用時間點對mTORC2信號通路的影響變化;7.IL-15-IGF-1的相互作用通過Real-time PCR、WB、胞內(nèi)流式細胞技術(shù)及免疫組織化學(xué)法的方法檢測IL-15與IGF-1相互關(guān)系,以驗證角質(zhì)細胞和DETCs在表皮層發(fā)揮交互協(xié)同的功能。結(jié)果1.雷帕霉素對表皮細胞的生物學(xué)效應(yīng)具有選擇性和劑量依賴性1.1設(shè)定雷帕霉素為四種不同的工作濃度(5 ng/ml,10 ng/ml,15 ng/ml,20 ng/ml)作用于表皮細胞,進行細胞計數(shù)預(yù)實驗。24小時后發(fā)現(xiàn)5 ng/ml雷帕霉素劑量組中表皮細胞數(shù)量較DMSO對照組平均增加1548個,余三種劑量組間細胞數(shù)量相似,最終決定5 ng/ml雷帕霉素作為小劑量,20 ng/ml雷帕霉素作為大劑量;1.2不同劑量雷帕霉素作用于表皮細胞12和24小時后,CCK-8實驗結(jié)果顯示:小劑量雷帕霉素組中細胞平均吸光度分別為0.782和0.77,均高于對照組;大劑量雷帕霉素刺激表皮細胞24小時后測得平均吸光度均低于對照組。說明小劑量雷帕霉素維持表皮細胞的存活,大劑量雷帕霉素作用后表皮細胞數(shù)量減少;1.3流式細胞技術(shù)實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn),不同劑量雷帕霉素刺激表皮細胞24小時后,小劑量雷帕霉素并不影響表皮細胞中DETCs的數(shù)量,大劑量雷帕霉素使得DETCs數(shù)量減少。2.雷帕霉素對創(chuàng)面愈合的作用具有劑量雙向效應(yīng),即小劑量促進愈合,大劑量延遲愈合2.1設(shè)定雷帕霉素為四種不同的劑量:4mg/kg、0.4 mg/kg、0.04 mg/kg和0.004 mg/kg。肉眼觀察創(chuàng)面愈合發(fā)現(xiàn)4mg/kg雷帕霉素組中小鼠創(chuàng)面愈合明顯延緩,0.04mg/kg組中小鼠創(chuàng)面愈合較正常對照組加快。最終決定在體實驗中0.04 mg/kg雷帕霉素作為小劑量,4mg/kg作為大劑量;2.2設(shè)計小鼠全層皮膚缺損的創(chuàng)面愈合實驗,制作創(chuàng)面愈合曲線發(fā)現(xiàn):0.04mg/kg小劑量雷帕霉素促進創(chuàng)面愈合的過程,4mg/kg大劑量雷帕霉素導(dǎo)致創(chuàng)面愈合明顯延緩;2.3制作創(chuàng)面后第3天、第6天小鼠創(chuàng)面病理組織經(jīng)石蠟包埋和HE染色后測量新生上皮長度。小劑量雷帕霉素組中新生上皮長度分別為901μm和1449μm,長于正常對照組的619μm和1058μm;大劑量雷帕霉素組中新生上皮長度分別為340μm和672μm,明顯少于正常對照組。說明小劑量雷帕霉素促進創(chuàng)面新生上皮形成,大劑量雷帕霉素使得創(chuàng)面再上皮化障礙。3.雷帕霉素對表皮中IL-15和IGF-1的表達呈劑量雙向效應(yīng),即小劑量促進IL-15和IGF-1的表達,大劑量抑制IL-15和IGF-1的表達3.1通過Real-time PCR、WB、胞內(nèi)流式細胞技術(shù)的方法檢測表皮細胞中IL-15和IGF-1的表達變化,發(fā)現(xiàn)小劑量雷帕霉素刺激10分鐘即促進IL-15和IGF-1的表達上調(diào),持續(xù)至24小時;大劑量雷帕霉素則顯著抑制IL-15和IGF-1的表達;3.2通過WB、免疫組織化學(xué)染色法發(fā)現(xiàn),創(chuàng)面愈合過程中表皮層中IL-15和IGF-1在創(chuàng)面愈合早期即進入表達上調(diào)的高峰,一直持續(xù)到創(chuàng)面愈合的再上皮化期;大劑量雷帕霉素則明顯抑制創(chuàng)面愈合全過程中IL-15和IGF-1的表達。4.在表皮細胞和創(chuàng)周表皮中,雷帕霉素對m TOR通路的影響具有劑量依賴性和時間依賴性4.1在表皮細胞和創(chuàng)周表皮中,小劑量雷帕霉素對m TORC1通路的表達無明顯影響;在表皮細胞中,小劑量雷帕霉素可快速激活p-SIN1(Thr86),促使p-Akt(Ser473)激活,從而全面激活A(yù)kt/m TORC2通路;在創(chuàng)面愈合過程中,在小劑量雷帕霉素的作用下,創(chuàng)周表皮中p-Akt(Ser473)也被激活;4.2在表皮細胞和創(chuàng)周表皮中,大劑量雷帕霉素顯著抑制下游分子p-p70S6K(Thr389)和p-4E-BP1(Thr37/46)的表達,故mTORC1通路被抑制。延長作用時間后,p-Akt(Ser473)表達顯著下調(diào),抑制了mTORC2通路;5.角質(zhì)細胞分泌的IL-15可促進DETCs分泌IGF-1增加,而DETCs分泌的IGF-1可促進角質(zhì)細胞分泌IL-15增加。5.1通過胞內(nèi)流式細胞染色技術(shù),發(fā)現(xiàn)rm IL-15可促進表皮細胞中IGF-1含量增加,rm IL-15和小劑量雷帕霉素共同作用后進一步的促進IGF-1分泌增多;通過Real-time PCR、WB方法,發(fā)現(xiàn)rm IGF-1可促進角質(zhì)細胞分泌IL-15升高;5.2在糖尿病小鼠難愈性創(chuàng)面模型中,創(chuàng)面愈合過程中創(chuàng)周注射rm IL-15可促進創(chuàng)面愈合加速;免疫組織化學(xué)法檢測發(fā)現(xiàn)糖尿病小鼠創(chuàng)周給予rm IL-15或rm IGF-1,可對應(yīng)的促進創(chuàng)面邊緣表皮中IGF-1或IL-15升高;這些結(jié)果提示我們,在表皮細胞中角質(zhì)細胞分泌的IL-15和DETCs分泌的IGF-1相互影響。結(jié)論總結(jié)本課題的研究結(jié)果,可以得到以下結(jié)論:1.雷帕霉素對表皮細胞的生物學(xué)效應(yīng)具有選擇性和劑量依賴性;2.雷帕霉素對創(chuàng)面愈合的作用具有劑量雙向效應(yīng),即小劑量促進愈合,大劑量延遲愈合;3.雷帕霉素對表皮中IL-15和IGF-1表達呈劑量雙向效應(yīng),即小劑量促進,大劑量抑制;4.在表皮細胞和創(chuàng)周表皮中,雷帕霉素對m TOR通路的影響具有劑量依賴性和時間依賴性;5.表皮中,角質(zhì)細胞分泌的IL-15和DETCs分泌的IGF-1相互影響、相互作用。
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【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R64

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1 白楊;雷帕霉素對創(chuàng)面愈合的影響及其機制研究[D];第三軍醫(yī)大學(xué);2017年

2 劉聰;Ghrelin對放燒復(fù)合傷創(chuàng)面的促愈效應(yīng)及機制研究[D];第三軍醫(yī)大學(xué);2017年

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本文編號：2407452