【摘要】：目的皮膚作為人體最大的器官,其在調(diào)節(jié)體溫、排泄代謝廢物以及維持機體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定等方面均發(fā)揮著重要作用。但是,皮膚在日常生活以及戰(zhàn)(創(chuàng)、燒)傷中也最易受到損傷。輕度受損的皮膚可以依據(jù)其未損傷的細胞與組織為模板,依靠皮膚自身的再生潛力完成其自我修復的過程；但重度大面積損傷的皮膚卻喪失其原有的組織結(jié)構與功能,皮膚中具備修復潛能的干細胞與組織被嚴重破壞,其自我修復的潛能也隨之喪失殆盡。目前對于大面積深度燒傷的治療,仍存在諸多困難,如愈合后瘢痕攣縮、供體皮膚來源不足、異體或異種皮的免疫排斥反應等。隨著組織工程學的誕生,人們開始應用分子生物學、細胞生物學、組織工程學及醫(yī)學科學等原理和技術構建各類皮膚替代物。因此,如何能在皮膚損傷的早期利用各項技術和措施來修復與重建損傷皮膚已經(jīng)成為當前皮膚再生研究的新方向。脫細胞異體真皮基質(zhì)(acellular allogeneic dermal matrix, allo-ADM)是用理化方法脫除異體表皮和真皮中所有細胞成份,保留細胞外基質(zhì)的形態(tài)結(jié)構,并完整保留位于表皮層和真皮層之間的基底膜。其具有完整的膠原三維結(jié)構和高生物相容性,是一種良好的真皮替代物,在組織成分上與自體皮膚最相近,可以作為一種理想的皮膚移植物。由于除去了表皮和真皮中可引發(fā)被宿主識別的外來細胞成份從而去除了抗原性,移植在受體創(chuàng)面上不發(fā)生免疫排斥,為永久性真皮覆蓋物。Allo-ADM的存在為受體成纖維細胞血管內(nèi)皮細胞重新定植和血管新生提供了良好的誘導支架,在allo-ADM中重新定居的成纖維細胞保持產(chǎn)生成熟基質(zhì)的能力。另外,基底膜的存在非常有利于表皮細胞的生長增殖與分化。但由于基底膜仍具有較強的免疫原性,且異體皮來源主要來源為保存完好的尸體皮,來源十分有限,受到倫理學的制約,且存在有傳染疾病的危險,其應用受到極大的限制。異種無細胞真皮基質(zhì)(xenogeneic acellular dermal matrix, xeno-ADM)也是真皮基質(zhì)的來源之一,最常用的異種真皮為豬皮。豬皮和人的皮膚在組織結(jié)構物性狀和免疫方面有許多相似之處,且來源廣泛,是異種真皮的最佳材料。Xeno-ADM的制作同allo-ADM的制作基本相同,處理后也去除了誘發(fā)免疫排斥反應的細胞成分并且保留了完整的細胞外基質(zhì)。但由于物種間存在組織蛋白的差異,xeno-ADM的免疫原性要比allo-ADM強。Xeno-ADM的應用存在缺陷：存在較強的免疫原性；血管化速度緩慢；潛在異源性病毒微生物感染風險。我們在以往的研究中發(fā)現(xiàn),在深Ⅱ度燒傷和混合燒傷中,存在一種沒有全層壞死的特殊真皮組織,此類組織中可見細胞新陳代謝障礙、細胞功能低下、形態(tài)學改變等一系列變化,但在局部環(huán)境改善后,具有可逆恢復至正常形態(tài)和功能的特點,通常把這部分沒有完全壞死的真皮稱為變性真皮。由于熱損傷等損傷因素存在,變性真皮中含有大量細胞外基質(zhì)(Extracellular matrix, ECM)降解物,其具有多種強大的生物學活性,包括誘導炎癥反應、誘導細胞遷移、促進細胞增殖等,稱為細胞外基質(zhì)活性肽。細胞外基質(zhì)活性肽可對傷患產(chǎn)生極大影響,可引起休克、心律失常等致命并發(fā)癥。以往的經(jīng)驗是將變性皮膚視為焦痂或痂皮,將其切除后覆蓋臨時覆蓋物,近年來有學者提出可行磨痂術以保留變性真皮,可以促進燒傷創(chuàng)面愈合。但其中的細胞外基質(zhì)活性肽仍然會對傷患產(chǎn)生不利影響。因此,我們提出,能否將燒傷皮膚完全切除,利用組織工程學相關處理措施,祛除其中的不利因素,利用其中的膠原成分和部分活性因子,變成一種新型的真皮支架,使其廢物利用,發(fā)揮更為合理、促進創(chuàng)面愈合的作用,既可以減少免疫排斥和炎性反應,又能加速燒傷創(chuàng)面的愈合。在本研究中,我們將深度燒傷皮膚進行了組織工程學加工,將真皮基質(zhì)中的降解物進行無害化處理,制作了深度燒傷真皮基質(zhì)(Deep-degree burned dermal matrix, DDBDM),對其進行了理學性能及生物學性能初步評價。并選擇小鼠作為研究對象,針對其中的細胞因子進行蛋白質(zhì)芯片實驗,明確脫細胞措施對其中的細胞因子有何影響。材料與方法1.深度燒傷動物模型的建立：選用Wistar大鼠、昆明小鼠、Balb/c小鼠作為實驗動物,采用恒溫恒壓燙傷法及恒溫水浴燙傷法作為致傷方法,根據(jù)致傷深度均勻性及可重復性優(yōu)選出最佳的致傷方法。2. DDBDM的制備及其物理性能和生物相容性評價2.1 DDBDM的制備方法篩選及其優(yōu)化：切取燒傷部位皮膚進行胰蛋白酶-Triton X-100方法進行脫細胞處理,按其濃度不同分為A組：0.1%胰蛋白酶、0.1%Triton X-100組,B組：0.25%胰蛋白酶、0.5%Triton X-100組,C組：0.5%胰蛋白酶、1%Triton X-100組,設定恒溫振蕩儀于37℃,設定振蕩頻率為100rpm,設置不同振蕩時間1h、2h、4h,使用無菌PBS緩沖液進行振蕩漂洗,直至PBS溶液變清亮。根據(jù)制得的真皮支架的完整性及其脫細胞的程度進行制備條件的初步篩選。2.2根據(jù)DDBDM的大體觀察、組織學觀察、物理性能檢測、生物相容性檢測結(jié)果進行DDBDM的性能評價。2.2.1 DDBDM的一般性能評價2.2.1.1觀察DDBDM的外觀、厚度、色澤、彈性情況等指標并記錄。2.2.1.2物理性能檢測：將DDBDM進行機械強度測定、降解率測定,評價其一般性能。2.2.1.3組織學檢查及評價：將DDBDM進行HE染色,觀察膠原排列變化情況。2.2.2 DDBDM的生物相容性評價按中華人民共和國國家標準之醫(yī)療器械生物學評價方法之第6部分：植入后局部反應試驗(GB/T 16886.6-1997)進行小鼠背部植入實驗,以ADM為對照,觀察DDBDM的纖維化和炎癥程度、材料／組織界面炎性細胞類型及其數(shù)量和分布、確定DDBDM是否存在壞死及DDBDM溶解程度、肉芽腫形成情況等。3. DDBDM與ADM細胞因子差異分析以Balb/c小鼠為研究對象,將正常皮膚、深度燒傷皮膚、ADM與DDBDM進行細胞因子蛋白芯片實驗,研究其中308中細胞因子水平變化,并將其進行統(tǒng)計學分析,觀察燒傷及脫細胞過程對其中細胞因子變化的影響作用并分析其相關機制。結(jié)果1.恒溫恒壓電燙儀和恒溫水浴燙傷法是穩(wěn)定的可重復制作深度燒傷動物模型的可靠方法,對于本實驗,使用恒溫水浴燙傷法能制作更穩(wěn)定及燙傷深度更均勻的深度燙傷動物模型。2.將深度燒傷皮膚放置于0.25%胰蛋白酶-0.5% Triton X-100混合溶液中,并于37℃恒溫振蕩儀中,在一定頻率下進行脫細胞處理后,可成功制備深度燒傷真皮基質(zhì)(DDBDM),其一般性能符合真皮替代物的基本條件。3.經(jīng)過皮下埋植實驗證實DDBDM具有良好的生物相容性。4.經(jīng)細胞因子蛋白芯片實驗結(jié)果證實：DDBDM中比ADM無過多的有害細胞因子,其中部分細胞因子水平的變化有減少瘢痕形成,促進創(chuàng)面愈合的作用。結(jié)論在本研究中,DDBDM的制作方法被最終確定；將ADM和DDBDM中的細胞因子進行比較后發(fā)現(xiàn),DDBDM中沒有過多的有害細胞因子,對機體不會產(chǎn)生過多的損害。所以DDBDM可以成為一種理想的真皮替代物材料。如果能有一種有效方法來減少對組織有害的炎性因子,且能夠更有效的利用其中的有益細胞因子,那么可以減少其副作用,而且可以提高它的良性作用比如種子細胞的浸潤、血管生成和細胞外基質(zhì)重建。由于DDBDM來源于自體真皮基質(zhì),異源性或異體真皮基質(zhì)的組織不相容性則不存在。然而,本實驗有局限性,有關調(diào)節(jié)關鍵細胞因子的實驗未能實施,所以在體內(nèi)這些細胞因子如何發(fā)揮效應未能得知。而且,應用DDBDM作為真皮替代物來修復燒傷創(chuàng)面,能否加速創(chuàng)面修復也不甚明了。在以后的研究中,將針對某一具體細胞因子進行體內(nèi)外實驗來進一步研究解決這些問題。
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【學位授予單位】：山東大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R644

【參考文獻】

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本文編號：2393675