【摘要】：第一部分Bafilomycin A1抑制鈷納米顆粒誘導的小鼠巨噬細胞細胞毒性和促炎細胞因子的釋放的實驗研究目的:研究Bafilomycin A1對鈷納米顆粒(Co NPs)誘導的小鼠巨噬細胞細胞毒性和炎癥反應的保護作用。方法:(1)采用不同濃度的Co NPs、Co2+和Bafilomycin A1對RAW264.7細胞進行甲基噻唑基四唑(Methyl thiazolyl tetrazolium,MTT)法檢測細胞生存率;(2)通過對照組、Co NPs組、低劑量藥物組、高劑量藥物組四組MTT分析方法檢測細胞生存率比較,評估Bafilomycin A1對Co NPs細胞毒性的抑制作用;(3)采用DAPI對RAW264.7細胞核進行染色,熒光顯微鏡觀察細胞數量的變化;(4)掃描電鏡觀察各組RAW264.7細胞超微形態(tài)學的變化;(5)采用ELISA法檢測前炎癥因子TNF-α、IL-1β、IL-6的表達情況。結果:(1)Co NPs及Co2+對RAW264.7細胞的細胞毒性效應呈現時間、濃度依賴性;Bafilomycin A1(8n M,16n M)對RAW264.7細胞沒有細胞毒性;Co NPs和Co2+細胞毒性的起效濃度分別約為50、400μM;(2)隨著Bafilomycin A1作用濃度的增高RAW264.7細胞的細胞毒性逐漸減弱(P0.05);(3)熒光顯微鏡觀察隨著Bafilomycin A1作用濃度的增高RAW264.7細胞數量逐漸增加;(4)掃描電鏡觀察顯示Co NPs組的RAW264.7細胞偽足基本消失,且細胞明顯縮小;隨著Bafilomycin A1作用濃度的增高RAW264.7細胞的偽足逐漸增多,且細胞鋪展面積逐漸與對照組接近;(5)隨著Bafilomycin A1作用濃度的增高炎癥因子TNF-α、IL-1β、IL-6表達逐漸減弱(P0.05)。結論:Co NPs對RAW264.7細胞的細胞毒性效應強于Co2+;Bafilomycin A1(8n M,16n M)沒有細胞毒性。Bafilomycin A1對Co NPs所致RAW264.7細胞的細胞毒性和炎癥反應具有保護作用。第二部分Bafilomycin A1抑制鈷納米顆粒誘導的小鼠巨噬細胞向破骨細胞分化的實驗研究目的:研究探索Bafilomycin A1對Co NPs誘導的RAW264.7細胞分化的影響。方法:(1)RAW264.7細胞培養(yǎng)第5d,通過倒置相差顯微鏡觀察活體破骨細胞形態(tài)改變、TRAP染色、TRAP染色陽性細胞計數,從細胞形態(tài)學上來評估Bafilomycin A1抑制Co NPs誘導巨噬細胞向破骨細胞分化的作用;(2)培養(yǎng)第6d通過Real-time PCR檢測破骨細胞基因表達從基因水平來評估Bafilomycin A1抑制Co NPs誘導巨噬細胞向破骨細胞分化的作用。結果:(1)培養(yǎng)第5d,通過倒置相差顯微鏡觀察,Co NPs組不規(guī)則細胞數量增加,體積增大,多核細胞亦增多,其內的細胞核也增多。隨著Bafilomycin A1作用濃度的增加,多核細胞數目逐漸減少,多核細胞體積逐漸變小;通過TRAP染色,Co NPs組有大量TRAP染色陽性的破骨細胞形成,隨著Bafilomycin A1作用濃度的增加,TRAP染色陽性的破骨細胞數目逐漸減少(p0.05)。(2)培養(yǎng)第6d Real-time PCR檢測破骨細胞基因TRAP、RANK及Cath-K的表達,所得結果規(guī)律性與活體破骨細胞形態(tài)改變、TRAP染色結果一致。結論:小鼠RAW 264.7細胞能夠被RANKL誘導生成破骨細胞,Co NPs能夠加速誘導巨噬細胞向破骨細胞分化,Bafilomycin A1能夠抑制Co NPs誘導巨噬細胞向破骨細胞分化的進程,呈劑量依賴性。第三部分Bafilomycin A1對鈷納米顆粒誘導的小鼠巨噬細胞不良生物學效應保護作用的機制研究目的:研究pH值對Co NPs溶解的影響,通過H+-ATPase抑制劑Bafilomycin A1抑制RAW264.7對細胞內的Co NPs溶解的影響、TEM超微結構改變及氧化應激水平的影響,初步探討B(tài)afilomycin A1對Co NPs所致體內外不良生物學效應保護作用的機制。方法:(1)通過ICP-MS測量Co NPs在不同p H值培養(yǎng)基中釋放Co2+的水平;(2)各實驗組細胞通過ICP-MS測量及EDX能譜測試,評估Bafilomycin A1抑制細胞內Co NPs溶解作用;(3)利用TEM觀察各組RAW 264.7細胞超微結構的改變;(4)收集各組RAW 264.7細胞抽提液,通過GSH/GSSG、SOD、CAT、GPx水平檢測,評估Bafilomycin A1抑制細胞內氧化應激的作用。結果:(1)培養(yǎng)基中離子釋放呈現時間、p H值依賴關系,各時間點釋放的濃度均小于Co2+細胞毒性起效濃度;(2)細胞內Co NPs離子釋放呈現時間依賴關系,隨著Bafilomycin A1作用濃度的增加,細胞內Co NPs離子釋放逐漸減少(P0.05);(3)Co NPs組RAW 264.7細胞內溶酶體和濾泡的數目急劇增多,Co NPs被溶酶體吞噬,伴有細胞器消失;隨著Bafilomycin A1作用濃度的增高,RAW 264.7細胞內溶酶體和濾泡的數目逐漸減少,同時消失的細胞器再次出現;(4)Co NPs組GSH、SOD、GPx、CAT水平明顯降低,隨著Bafilomycin A1作用濃度的增高,GSH、SOD、GPx、CAT水平相應升高。結論:Co NPs的溶解度在細胞外環(huán)境中很低,在細胞內低p H值環(huán)境的溶酶體中更容易溶解釋放大量鈷離子,從而破壞細胞抗氧化防御機制,引起氧化應激損傷,是Co NPs引起細胞毒性反應、炎癥反應及誘導破骨細胞分化等一系列不良生物學反應的根本原因。第四部分Bafilomycin A1抑制鈷納米顆粒誘導的小鼠顱骨周圍急性炎癥反應和骨溶解作用的實驗研究目的:研究Bafilomycin A1對Co NPs誘導的小鼠顱骨周圍急性炎癥反應和骨溶解作用的影響。方法:(1)建立小鼠顱骨周圍急性炎癥反應和骨吸收注射模型,各組顱骨周圍軟組織病理學切片染色觀察及炎癥細胞計數分析;(2)各組顱骨病理學切片染色觀察及骨組織計量學數據測量;(3)各組Micro-CT分析;(4)各組顱骨周圍軟組織促炎細胞因子的測量。結果:(1)顱骨周圍軟組織病理學切片染色觀察及炎癥細胞計數分析結果提示Co NPs組細胞浸潤最密集,滿視野均是核染成深藍色巨噬細胞或淋巴細胞,隨著Bafilomycin A1作用濃度的增加,炎性細胞浸潤數目逐漸減少(p0.05)。(2)顱骨病理學切片染色觀察及骨組織計量學數據測量結果提示Co NPs組的樣本可見顱骨骨吸收明顯,伴炎性細胞浸潤。隨著Bafilomycin A1作用濃度的增加,骨吸收破壞范圍減小,溶解面積減小,炎性細胞浸潤數目逐漸減少。(3)Micro-CT分析結果提示Co NPs組骨吸收明顯、隨著Bafilomycin A1作用濃度的增加,骨吸收破壞范圍減小。隨著Bafilomycin A1作用濃度的增加BMD和BMC顯著升高(P0.05)。(4)顱骨周圍軟組織促炎細胞因子表達結果提示Co NPs組軟組織內TNF-α、IL-1β及IL-6蛋白表達量顯著增高(P0.05)。隨著Bafilomycin A1的劑量的增加而降低,呈劑量依賴性(P0.05)。結論:Co NPs可以誘導小鼠顱骨周圍產生炎癥反應,分泌參與破骨細胞調控的TNF-α,IL-1β和IL-6等炎癥性細胞因子,引起顱骨骨吸收。Bafilomycin A1具有抑制Co NPs誘導的小鼠顱骨周圍產生炎癥反應,抑制顱骨骨吸收的作用,呈劑量效應關系。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：蘇州大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R687.4

【共引文獻】

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本文編號：2386996