【摘要】：目的通過SD大鼠體內(nèi)和體外實驗,探討創(chuàng)傷后骨性關(guān)節(jié)炎進(jìn)程中關(guān)節(jié)軟骨GPR48表達(dá)變化及其與炎癥免疫反應(yīng)因子之間的表達(dá)聯(lián)控關(guān)系,嘗試進(jìn)一步揭示創(chuàng)傷后骨性關(guān)節(jié)炎進(jìn)程中內(nèi)在分子機制,為創(chuàng)傷后骨性關(guān)節(jié)炎的研究和治療提供新思路。方法(A)體外實驗:SPF級雌性4周齡SD大鼠21只,應(yīng)用頸椎脫臼法處死大鼠,醫(yī)用酒精浸泡30min,嚴(yán)格無菌條件下取軟骨組織,眼科剪剪碎組織法進(jìn)行原代培養(yǎng)和傳代培養(yǎng),用甲苯胺藍(lán)染色法和COL-II免疫細(xì)胞化學(xué)染色法進(jìn)行軟骨細(xì)胞鑒定。取第3代細(xì)胞隨機分為加完全培養(yǎng)基組(對照組)、LPS(濃度為20mg/m L)干預(yù)組和IL-1β(濃度為10ng/m L)干預(yù)組;三組分別在0.5h、1h、6h、24h、48h后,提取各時間點細(xì)胞蛋白,BCA法進(jìn)行蛋白含量測定,應(yīng)用Western Blot法檢測GPR48、TLR4蛋白的表達(dá),Image J半定量分析蛋白表達(dá)。(B)體內(nèi)實驗:SPF級雌性4周齡SD大鼠48只,隨機分為對照組和實驗組,對照組12只,實驗組36只。實驗組大鼠行雙側(cè)前交叉韌帶(ACL)橫斷、內(nèi)側(cè)半月板切除誘導(dǎo)PTOA,大鼠對照組膝關(guān)節(jié)打開關(guān)節(jié)囊后即逐層縫合(行假手術(shù)),兩組動物按2w、4w、6w末分別處死并取膝關(guān)節(jié)標(biāo)本,4%多聚甲醛固定2周,EDTA脫鈣2個月,石蠟包埋切片后,進(jìn)行一般染色(HE)和特殊染色(Masson、VG)觀察,免疫組織化學(xué)染色法檢測關(guān)節(jié)軟骨GPR48、COL-II和TLR4蛋白的表達(dá);光學(xué)顯微鏡下觀察并應(yīng)用IRS評分標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評分。應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計學(xué)軟件,采用單因素方差分析檢驗方法和Pearson相關(guān)性分析對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理,P0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)果(A)體外實驗:1甲苯胺藍(lán)染色:正常軟骨細(xì)胞分泌特征性的酸性糖胺多糖能被甲苯胺藍(lán)染成紫紅色,軟骨細(xì)胞甲苯胺藍(lán)染色后呈異染性。2 COL-II免疫細(xì)胞化學(xué)染色法:COL-II是軟骨細(xì)胞特異性的分泌物,因此采用COL-II免疫細(xì)胞化學(xué)染色證明軟骨細(xì)胞COL-II呈陽性表達(dá),胞漿內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒。3 Western Blot法檢測GPR48和TLR4因子的表達(dá):隨干預(yù)時間延長,實驗組(LPS和IL-1β)中GPR48表達(dá)逐漸降低(P0.05),對照組中GPR48表達(dá)在不同時間點間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05);TLR4在實驗組(LPS和IL-1β組)中隨干預(yù)時間延長表達(dá)逐漸升高(P0.05),對照組中TLR4表達(dá)在不同干預(yù)時間點間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。IL-1β干預(yù)組不同時間點間GPR48與TLR4表達(dá)量之間呈負(fù)相關(guān)(r=-0.991,P0.05);LPS干預(yù)組不同時間點間GPR48與TLR4表達(dá)量之間呈負(fù)相關(guān)(r=-0.997,P0.05)。(B)體內(nèi)實驗:成功制備出SD大鼠創(chuàng)傷后骨性關(guān)節(jié)炎動物模型。1關(guān)節(jié)軟骨HE染色:對照組膝關(guān)節(jié)軟骨表面光滑,軟骨陷窩內(nèi)軟骨細(xì)胞排列整齊、規(guī)則,軟骨下骨小梁粗大完整。實驗組2w膝關(guān)節(jié)面相對較好,可見軟骨陷窩內(nèi)軟骨細(xì)胞排列較整齊,可見細(xì)胞簇聚,軟骨下骨小梁排列較好,骨小梁厚度增加;實驗組4w可見軟骨表層細(xì)胞丟失,有細(xì)胞克隆出現(xiàn),細(xì)胞形態(tài)比較正常,排列較紊亂,軟骨下骨小梁增多,小梁間間隙變小。實驗組6w可見軟骨細(xì)胞丟失嚴(yán)重,細(xì)胞形態(tài)異常,且細(xì)胞排列紊亂,潮線前移,軟骨下骨小梁增多,小梁間間隙更小,且排列紊亂。2關(guān)節(jié)軟骨Masson三色染色:結(jié)果可見軟骨基質(zhì)膠原纖維染成藍(lán)色,紅細(xì)胞及肌纖維呈紅色,細(xì)胞核呈藍(lán)黑色。實驗組可見軟骨基質(zhì)隨時間延長而減少,基質(zhì)染色變淺,紅染區(qū)減少;對照組無明顯變化,且實驗組與對照組單位面積內(nèi)膠原含量2w、4w、6w相比顯著降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。3關(guān)節(jié)軟骨VG染色:結(jié)果可見膠原纖維染紅色。實驗組可見軟骨基質(zhì)隨時間延長而減少,基質(zhì)染色變淺,紅染區(qū)減少。對照組無明顯變化。且實驗組與對照組單位面積內(nèi)膠原含量2w、4w、6w相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。4免疫組織化學(xué)染色檢測關(guān)節(jié)軟骨中GPR48與COL-II、TLR4:GPR48與COL-II蛋白的陽性染色呈棕黃色顆粒,均可在軟骨細(xì)胞表達(dá);實驗組各時間點GPR48與COL-II蛋白的表達(dá)都低于對照組(P0.05)。TLR4蛋白的陽性染色呈棕黃色顆粒,位于細(xì)胞膜和細(xì)胞漿,主要表達(dá)于軟骨細(xì)胞,成骨細(xì)胞和骨細(xì)胞也可見少量表達(dá)。實驗組各個時間點TLR4蛋白的表達(dá)均高于對照組(P0.05),實驗組不同時間點GPR48與TLR4蛋白的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(r=-0.925,P0.05)。結(jié)論1本實驗成功復(fù)制了SD大鼠創(chuàng)傷后骨性關(guān)節(jié)炎模型,并在一定程度上反映出了骨性關(guān)節(jié)炎的病理變化,為后期研究建立了良好的平臺。2體外實驗表明,關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞在炎性因子IL-1β、LPS分別刺激下,GPR48表達(dá)下調(diào),TLR4上調(diào),兩者之間表達(dá)量呈負(fù)相關(guān)關(guān)系,表明炎性環(huán)境下,GPR48負(fù)性調(diào)控軟骨細(xì)胞的免疫炎癥反應(yīng)。3體內(nèi)實驗表明,隨創(chuàng)傷后骨性關(guān)節(jié)炎病程發(fā)展,關(guān)節(jié)軟骨GPR48表達(dá)逐漸下降,TLR4表達(dá)逐漸升高,說明GPR48在調(diào)控骨性關(guān)節(jié)炎進(jìn)程中發(fā)揮著重要作用。4在創(chuàng)傷后骨性關(guān)節(jié)炎的發(fā)展進(jìn)程中,GPR48與炎癥反應(yīng)因子TLR4表達(dá)呈負(fù)相關(guān),說明GPR48及其介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)共同參與骨性關(guān)節(jié)炎調(diào)控,從而為理解骨性關(guān)節(jié)炎癥的分子機制和建立新的治療靶點提供了一個嶄新思路。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：華北理工大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R684.3

【共引文獻(xiàn)】

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本文編號：2338100