【摘要】：第一部分原代海馬神經(jīng)元的培養(yǎng)、形態(tài)學(xué)觀察以及純度鑒定目的:通過對新生24h內(nèi)SD大鼠海馬神經(jīng)元培養(yǎng),掌握大鼠海馬神經(jīng)元體外培養(yǎng)的方法,利用免疫熒光細胞化學(xué)鑒定神經(jīng)元純度。方法:取新生24 h內(nèi)的SD乳鼠,用75%乙醇消毒,剪斷頭,分層剪開皮膚和顱骨,用彎鑷取出大腦,置于預(yù)冷的DMEM液中,快速剝離出兩側(cè)海馬組織,在解剖顯微鏡下去除海馬的血管和被膜,用顯微剪把組織剪碎,再移入木瓜蛋白酶和DNA酶Ⅰ的混合消化液中,置于37℃,5%CO2培養(yǎng)箱中消化30 min。用吸管將組織塊移入含有10%胎牛血清的DMEM液中終止消化5min,再把組織塊移入接種培養(yǎng)基中,用1ml長槍頭勻速、輕柔地反復(fù)吹打,直至液體變渾濁,沒有塊狀物質(zhì),之后過200目的細胞篩。在顯微鏡下進行活細胞計數(shù),制成1x106/ml密度的細胞懸液,種植于多聚賴氨酸處理過的6孔培養(yǎng)板中,每孔加2.5ml,置于37℃,5%CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。6h后全量更換無血清的維持培養(yǎng)基。以后,每隔一天半量換液一次。在第四天的時候,加入終濃度10m M的5fu和尿嘧啶,來抑制膠質(zhì)細胞的生長。在顯微鏡下觀察神經(jīng)元的生長情況。海馬神經(jīng)元培養(yǎng)7d后,應(yīng)用免疫熒光化學(xué)技術(shù),用熒光標(biāo)記的MAP-2標(biāo)記神經(jīng)元,DAPI標(biāo)記所有細胞的細胞核。在熒光顯微鏡下,隨機選取5個孔,分為5組,分別在低倍視野(4×10)和高倍視野(10×20倍)下觀察,拍照。計數(shù)神經(jīng)元和所有細胞核的數(shù)目,并計算神經(jīng)元所占的百分比,取均值作為每孔神經(jīng)元純度。結(jié)果:原代培養(yǎng)海馬神經(jīng)元,神經(jīng)元標(biāo)志物單克隆神經(jīng)元微管相關(guān)蛋白-2(MAP-2)抗體和核抗體DAPI熒光染色后,在熒光倒置顯微鏡下鑒定,計算海馬神經(jīng)元純度約為(91.52±1.70)%。小結(jié):體外培養(yǎng)的原代SD新生乳鼠海馬神經(jīng)元形態(tài)典型,且海馬神經(jīng)元純度在90%以上,能夠滿足進一步的實驗要求。第二部分不同濃度的氯胺酮對海馬神經(jīng)元樹突棘的影響目的:觀察不同濃度氯胺酮對發(fā)育期海馬神經(jīng)元樹突棘的影響。方法:取原代培養(yǎng)至第5 d的海馬神經(jīng)元,隨機分為4組:(1)C組(空白對照組):加入等體積的維持培養(yǎng)基(2)K1組:加入氯胺酮,終濃度為100μM(3)K2組:加入氯胺酮,終濃度為300μM(4)K3組:加入氯胺酮,終濃度為500μM。各組繼續(xù)培養(yǎng)6小時后,固定,用熒光染料V22888染色。之后,在共聚焦顯微鏡下觀察,隨機攝取熒光圖片,并計算各組神經(jīng)元樹突棘的密度以及平均長度。結(jié)果:1樹突棘的密度(F=13.298,P=0.002):K2組及K3組與C組比較,數(shù)值有所降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05);K1組與C組比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義。K3組與K2組比較,數(shù)值有所降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05);2樹突棘的平均長度(F=30.440,P=0.000):K2組及K3組與C組比較,數(shù)值有所降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05);K1組與C組比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義。K3組與K2組比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義。小結(jié):氯胺酮對海馬神經(jīng)元樹突棘的影響具有劑量依賴性。隨著氯胺酮濃度的升高,其對樹突棘的損傷也越明顯,其神經(jīng)毒性作用就越強。第三部分氯胺酮對原代培養(yǎng)海馬神經(jīng)元的神經(jīng)毒性的作用機制目的:1應(yīng)用Westem blot技術(shù)檢測使用氯胺酮后RhoA及其下游分子ROCK的表達量的變化,以及使用Y-27632后RhoA和ROCK蛋白表達的變化。2應(yīng)用免疫熒光細胞化學(xué)技術(shù)標(biāo)記神經(jīng)元樹突棘,闡明RhoA-ROCK信號通路在氯胺酮對原代培養(yǎng)的海馬神經(jīng)元毒性中的作用。方法:取原代培養(yǎng)至第5 d的海馬神經(jīng)元,隨機分為4組:(1)C組(空白對照組):加入等體積的維持培養(yǎng)基(2)Y組:加入Y-27632,終濃度為10μM(3)K組:加入氯胺酮,終濃度為300μM(4)K+Y組:加入氯胺酮和Y-27632,終濃度分別為300μM和10μM。1將各組再培養(yǎng)6小時后,提取蛋白,應(yīng)用Western blot技術(shù)檢測各組RhoA和ROCK蛋白表達的變化。2將各組再培養(yǎng)6小時后,用V22888染色,在共聚焦顯微鏡下觀察各組神經(jīng)元樹突棘的變化。結(jié)果:1 RhoA(F=404.774,P=0.000):Y組與C組比較,RhoA蛋白表達量差異無統(tǒng)計學(xué)意義;K組與C組比較,RhoA蛋白表達表達顯著增高,且有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。K+Y組與K組比較,RhoA蛋白表達量差異無統(tǒng)計學(xué)意義;2 ROCK(F=721.413,P=0.000):Y組與C組比較,ROCK蛋白表達量差異無統(tǒng)計學(xué)意義;K組與C組比較,ROCK蛋白表達表達顯著增高,且有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。K+Y組與K組比較,ROCK蛋白表達量顯著降低,且差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05);3樹突棘的密度(F=11.383,P=0.003):Y組與C組比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義;K組與C組比較,數(shù)值有所降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。K+Y組與K組比較,數(shù)值有所升高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05);4樹突棘的平均長度(F=26.152,P=0.000):Y組與C組比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義;K組與C組比較,數(shù)值有所降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。K+Y組與K組比較,數(shù)值有所升高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。小結(jié):1氯胺酮可通過激活RhoA-ROCK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路損傷神經(jīng)元樹突棘,并發(fā)揮其神經(jīng)毒性作用。2 Y-27632可減輕氯胺酮對樹突棘的損傷,減弱氯胺酮的神經(jīng)毒性作用,從而起到神經(jīng)保護作用。結(jié)論:氯胺酮可通過RhoA-ROCK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路發(fā)揮神經(jīng)毒性作用。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R614

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