【摘要】：背景:三陰性乳腺癌(Triple negative breast cancer,TNBC)作為乳腺癌的一個(gè)亞型,具有惡性程度高、治療手段少、預(yù)后較差等特點(diǎn)。因而,解析TNBC惡性進(jìn)展的分子機(jī)理,尋找有效的治療靶點(diǎn)對(duì)其進(jìn)行早期干預(yù)尤為重要。微小RNA(micro RNA)是一類由內(nèi)源基因編碼的非編碼單鏈RNA分子,在基因的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控中發(fā)揮不可忽視的作用。micro RNA通過(guò)負(fù)性調(diào)控靶基因的表達(dá),在諸如個(gè)體發(fā)育、細(xì)胞分化、增殖和凋亡等生理活動(dòng)以及惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展等病理過(guò)程中起調(diào)控作用。EZH2是miR-340的一個(gè)潛在靶點(diǎn),可以催化組蛋白H3氨基末端的第27位賴氨酸發(fā)生三甲基化(H3K27me3),發(fā)揮基因沉默的作用。本課題擬通過(guò)對(duì)臨床病理組織標(biāo)本及體內(nèi)、外功能實(shí)驗(yàn)進(jìn)行研究,揭示miR-340通過(guò)靶向EZH2可逆轉(zhuǎn)參與三陰性乳腺癌進(jìn)展的一系列miRNAs異常表達(dá),發(fā)揮腫瘤抑制作用,從而為TNBC發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制研究提供更深入的理解,為基于EZH2的TNBC個(gè)體化治療提供理論依據(jù)。方法:1.分別應(yīng)用熒光原位雜交技術(shù)和免疫組織化學(xué)技術(shù)檢測(cè)乳腺癌組織及其相應(yīng)癌旁組織中miR-340、EZH2的差異表達(dá)情況。比較每組癌組織及其相應(yīng)癌旁組織間miR-340和EZH2的不同表達(dá)情況,對(duì)每組表達(dá)水平進(jìn)行評(píng)分,分析miR-340與EZH2表達(dá)水平的相關(guān)性。2.應(yīng)用RT-PCR及Western-blotting技術(shù)分別檢測(cè)不同乳腺癌細(xì)胞系中miR-340、EZH2的表達(dá)情況。篩選出差異表達(dá)最顯著的細(xì)胞系:MDA-MB-231及MDA-MB-468細(xì)胞系。3.應(yīng)用生物信息預(yù)測(cè)軟件得到miR-340的潛在靶點(diǎn)EZH2。沉默/過(guò)表達(dá)TNBC細(xì)胞系MDA-MB-231及MDA-MB-468中miR-340的表達(dá)水平后,應(yīng)用Western-blotting技術(shù)檢EZH2表達(dá)水平的變化;應(yīng)用熒光素酶實(shí)驗(yàn),檢測(cè)沉默/過(guò)表達(dá)miR-340后熒光素酶活性改變,明確EZH2是miR-340的靶基因。4.對(duì)沉默/過(guò)表達(dá)miR-340 TNBC細(xì)胞系,應(yīng)用MTT、平板克隆方法觀察細(xì)胞生長(zhǎng)能力的變化;應(yīng)用流式細(xì)胞學(xué)技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期及凋亡細(xì)胞比例的變化;應(yīng)用Transwell實(shí)驗(yàn)觀察細(xì)胞侵襲和遷移能力的變化;應(yīng)用免疫熒光技術(shù)檢測(cè)EMT標(biāo)志物E-cadherin、β-catenin表達(dá)水平及亞細(xì)胞定位的變化。5.構(gòu)建裸鼠皮下沉默/過(guò)表達(dá)miR-340的移植瘤模型。檢測(cè)miR-340表達(dá)水平改變對(duì)乳腺癌發(fā)生發(fā)展的影響。應(yīng)用免疫組織化學(xué)技術(shù)檢測(cè)miR-340、EZH2、Ki-67、MMP9在沉默/過(guò)表達(dá)miR-340的裸鼠移植瘤內(nèi)的表達(dá)水平,并對(duì)比兩組的變化。6.應(yīng)用免疫組化技術(shù)及Western-blot技術(shù)檢測(cè)過(guò)表達(dá)miR-340后EZH2下游miR-21、miR-200a/b通路上DNMT1、H3K27me3、p-STAT3表達(dá)水平的變化;應(yīng)用RT-PCR及免疫熒光技術(shù)檢測(cè)EZH2下游miR-21、miR-200a/b表達(dá)水平的變化。結(jié)果:1.通過(guò)對(duì)62例乳腺癌患者的癌組織及配對(duì)癌旁組織miR-340的熒光原位雜交技術(shù)檢測(cè)和EZH2的免疫組織化學(xué)檢測(cè),發(fā)現(xiàn):與癌旁組織相比,miR-340在癌組織中處于低表達(dá)狀態(tài),EZH2處于過(guò)表達(dá)狀態(tài)。對(duì)62例癌組織進(jìn)行miR-340與EZH2表達(dá)水平的綜合評(píng)分,發(fā)現(xiàn)二者表達(dá)水平負(fù)相關(guān)。2.對(duì)不同乳腺癌細(xì)胞系miR-340與EZH2的表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè),發(fā)現(xiàn)其在三陰性乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-231及MDA-MB-468中的表達(dá)水平與其他細(xì)胞系相比有顯著差異。3.生物信息學(xué)軟件預(yù)測(cè)結(jié)果顯示,miR-340與EZH2 3’非編碼區(qū)(3’UTR)具有潛在的結(jié)合位點(diǎn)。熒光素酶實(shí)驗(yàn)證實(shí)miR-340-Mim細(xì)胞系熒光素酶活性顯著降低,miR-340-Inh細(xì)胞系細(xì)胞系熒光素酶活性顯著升高。4.miR-340-Mim組細(xì)胞系細(xì)胞增殖能力顯著降低,細(xì)胞周期G0/G1期比例顯著升高,細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力降低,EMT上皮性標(biāo)志物E-cadherin表達(dá)水平升高、間質(zhì)性標(biāo)志物β-catenin表達(dá)水平降低;miR-340-Inh組細(xì)胞系細(xì)胞的增殖能力顯著升高,細(xì)胞周期G0/G1期比例顯著降低;EMT上皮性標(biāo)志物E-cadherin表達(dá)水平降低、間質(zhì)性標(biāo)志物β-catenin表達(dá)水平升高。5.構(gòu)建裸鼠移植瘤模型,對(duì)皮下移植瘤體積進(jìn)行測(cè)量,發(fā)現(xiàn):miR-340-Mim組移植瘤體積顯著小于對(duì)照組;miR-340-Inh組移植瘤生長(zhǎng)迅速。與對(duì)照組相比,miR-340-Mim移植瘤內(nèi)miR-340表達(dá)水平升高,EZH2、Ki-67、MMP9表達(dá)水平降低;miR-340-Inh移植瘤內(nèi)miR-340表達(dá)水平降低,EZH2、Ki-67、MMP9表達(dá)水平升高。6.miR-340-mim組細(xì)胞系DNMT1、H3K27me3、p-STAT3表達(dá)水平降低,miR-21表達(dá)水平顯著降低,miR-200a/b表達(dá)水平顯著升高。結(jié)論:1.臨床數(shù)據(jù)顯示,miR-340在乳腺癌組織中表達(dá)水平下調(diào),且與EZH2的表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)。2.研究證實(shí),EZH2是miR-340的一個(gè)分子靶點(diǎn)。3.miR-340在TNBC中發(fā)揮抑癌基因的作用,通過(guò)靶向EZH2,抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖、侵襲及遷移能力并促進(jìn)凋亡,同時(shí)對(duì)乳腺癌原位小鼠模型具有腫瘤抑制作用。調(diào)控乳腺癌細(xì)胞的增殖、克隆、細(xì)胞周期、凋亡以及侵襲轉(zhuǎn)移,抑制TNBC的成瘤性。4.miR-340靶向EZH2一方面通過(guò)下調(diào)P-STAT3、β-catenin表達(dá)逆轉(zhuǎn)miR-21的轉(zhuǎn)錄激活,另一方面通過(guò)下調(diào)DNMT1及H3K27me3表達(dá)逆轉(zhuǎn)miR-200a/b的表達(dá)沉默,從而抑制三陰性乳腺癌的進(jìn)展。
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【學(xué)位授予單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R737.9

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 ;MiRNA-429 suppresses the growth of gastric cancer cells in vitro[J];Journal of Biomedical Research;2012年05期

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本文編號(hào)：2335229